【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)如何指導(dǎo)視網(wǎng)膜色素變性的基因治療

視網(wǎng)膜色素變性（RP）是一組遺傳性眼病，主要影響視網(wǎng)膜中的感光細(xì)胞，導(dǎo)致視力逐漸喪失?；驒z測(cè)在RP的診斷和治療中發(fā)揮著重要作用，能夠識(shí)別與疾病相關(guān)的特定基因變異，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。

1. 基因檢測(cè)

基因檢測(cè)通過(guò)對(duì)患者的基因組進(jìn)行測(cè)序，識(shí)別與RP相關(guān)的突變。例如，CNGB1和RPGR基因的變異已被證明與常染色體隱性和顯性RP相關(guān)。研究顯示，CNGB1的變異可能占arRP病例的4%。此外，使用大型患者隊(duì)列的基因組測(cè)序，可以發(fā)現(xiàn)更多與RP發(fā)病機(jī)制相關(guān)的新靶點(diǎn)，如SLC66A1和SLC39A12。

2. 基因治療

基因治療是RP治療的前沿領(lǐng)域，旨在通過(guò)修復(fù)或替換缺陷基因來(lái)改善或恢復(fù)視力。近年來(lái)，科學(xué)家們利用AAV載體和CRISPR技術(shù)開(kāi)發(fā)了多種基因治療策略。例如，通過(guò)AAV載體恢復(fù)CNGB1的表達(dá)能夠顯著改善視力。此外，研究者們正在探索RPGR基因的修復(fù)方法，以恢復(fù)視網(wǎng)膜功能。

總的來(lái)說(shuō)，基因檢測(cè)和基因治療的結(jié)合為RP患者提供了新的希望，能夠在未來(lái)實(shí)現(xiàn)更有效的個(gè)性化治療。

3.  常染色體顯性連鎖突變

常染色體顯性遺傳病是研究最多的亞型，因?yàn)樗鼈兊膰?yán)重性；單個(gè)等位基因突變即可引起表型的改變。與常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性（adRP）相關(guān)的突變占病例的50%至75%。因此，迫切需要針對(duì)這些基因開(kāi)發(fā)新治療方法。已知許多基因與adRP的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。在《基因檢測(cè)如何指導(dǎo)視網(wǎng)膜色素變性的基因治療》中，總結(jié)了研究較多的基因（如RHO）及其他分子靶點(diǎn)的新進(jìn)展。

3.1. 視紫紅質(zhì)誘發(fā)的常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性

在視網(wǎng)膜色素變性（RP）患者中，最常見(jiàn)的突變之一是RHO基因突變，影響近25%的患者。近年來(lái)，針對(duì)視紫紅質(zhì)相關(guān)RP的治療方法的臨床前研究得到了大量關(guān)注。RHO突變引起的發(fā)病機(jī)制和生物分子變化已在細(xì)胞系和動(dòng)物模型（主要是嚙齒動(dòng)物）中得到了深入研究。在建立了有效的動(dòng)物模型后，科學(xué)界的興趣轉(zhuǎn)向了基因治療載體的開(kāi)發(fā)。

目前，針對(duì)表現(xiàn)出視紫紅質(zhì)突變的哺乳動(dòng)物模型的研究取得了新進(jìn)展，使得基因治療的臨床前階段主要集中在adRP的治療上。盡管如此，最近的研究在體內(nèi)模型中更好地表征了RHO基因在RP發(fā)病機(jī)制中的作用。例如，在非洲爪蟾蝌蚪中，通過(guò)CRISPR-Cas9誘導(dǎo)的RHO突變顯示，桿狀細(xì)胞的變性是由于Müller膠質(zhì)細(xì)胞增殖受抑制所致。在轉(zhuǎn)基因大鼠模型中，脯氨酸被亮氨酸（P347L）取代后，視紫紅質(zhì)的積累導(dǎo)致外核層迅速破壞。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路在P347L轉(zhuǎn)基因大鼠中通過(guò)顯著上調(diào)CHOP和BiP mRNA的表達(dá)而被激活。

研究表明，在轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬中，視紫紅質(zhì)突變P347S會(huì)影響視紫紅質(zhì)向光感受器外段的轉(zhuǎn)運(yùn)。Mussolino及其同事使用鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄抑制方法，通過(guò)含有KRAB（Krüppel相關(guān)框抑制物）結(jié)構(gòu)域的AAV2/8載體成功轉(zhuǎn)染RHO P347S轉(zhuǎn)基因小鼠，導(dǎo)致ERG反應(yīng)增強(qiáng)。該方法能夠降低突變體的轉(zhuǎn)錄水平，而不改變內(nèi)源性小鼠RHO基因的表達(dá)。最近的研究顯示，將鋅指與KRAB結(jié)構(gòu)域融合，并結(jié)合由GNAT1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RHO cDNA，可以在載體遞送后恢復(fù)RHO基因的野生型拷貝。Marrocco及其同事通過(guò)視網(wǎng)膜下注射成功抑制了含有突變RHO基因的豬體內(nèi)的內(nèi)源性表達(dá)，并用RHO的野生型拷貝取而代之，導(dǎo)致視網(wǎng)膜形態(tài)和功能的恢復(fù)。RNA替代療法在動(dòng)物模型中也顯示出了有效性。使用P347S轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究表明，通過(guò)載體遞送shRNA可以替換突變的視紫紅質(zhì)RNA轉(zhuǎn)錄本，從而導(dǎo)致視紫紅質(zhì)水平的升高和隨后的ERG反應(yīng)增強(qiáng)。CRISPR-Cas9系統(tǒng)在S334ter-3大鼠中也取得了成功，該大鼠具有特定等位基因RHO S334的突變，治療可改善視網(wǎng)膜的保存和視力。在RHO-P347S/Rd10和Rd10/Rd1小鼠中，分別通過(guò)視網(wǎng)膜下注射AAV-Cas9載體對(duì)Nrl和Nr2e3基因進(jìn)行敲除，也獲得了有希望的結(jié)果。NRL和NR2E3是參與視桿感光細(xì)胞分化和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，調(diào)節(jié)它們被證明是治療RP的有效方法。miRNA水平的失調(diào)與RP的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。miR-204突變與視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)。Karali及其同事證明，在RHO-P247S轉(zhuǎn)基因小鼠中注射AAV介導(dǎo)的pre-miR-204可以延緩視網(wǎng)膜退化，并減弱小膠質(zhì)細(xì)胞活化和感光細(xì)胞死亡，從而增強(qiáng)視網(wǎng)膜功能。此外，基于mirtron的miRNA表達(dá)調(diào)控在RP小鼠模型中成功抑制了基因表達(dá)。在Nrl.GFP/+、Rho P23H/+小鼠中，視網(wǎng)膜下注射AAV-mirtron載體（即AAV-M3.M5 H.RHO M3/5R）已被證明可以誘導(dǎo)視紫紅質(zhì)mRNA的替換，從而部分挽救視網(wǎng)膜變性。此外，還研究了攜帶視紫紅質(zhì)基因突變的Tvrm4小鼠，以了解Myriocin（一種神經(jīng)酰胺從頭合成抑制劑）的作用。Myriocin可以降低視網(wǎng)膜神經(jīng)酰胺，保持視網(wǎng)膜電圖記錄反應(yīng)，并降低視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激，表明它可能通過(guò)解毒和支持細(xì)胞存活起到作用。

視紫紅質(zhì)T17M突變體參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）通路的異常激活，并誘導(dǎo)感光細(xì)胞死亡。在轉(zhuǎn)基因C57BL6小鼠的研究表明，T17M視紫紅質(zhì)的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)IL-1β、IL-6和NFκB以及IB1A小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的上調(diào)。UPR通路的持續(xù)激活與感光細(xì)胞功能和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的喪失有關(guān)。在C57Bl/6小鼠的研究中，單次敲低(ATF4 +/−) T17M就足以產(chǎn)生治療反應(yīng)，顯著延緩視網(wǎng)膜變性，而雙重敲低則增強(qiáng)了觀(guān)察到的效果。T17M誘導(dǎo)的RP小鼠中ATF4缺乏與pEIF2α、ATF6和CHOP表達(dá)的下降有關(guān)。

3.2. 非視紫紅質(zhì)相關(guān)常染色體顯性突變

前mRNA加工因子（PRPF）突變與多達(dá)20%的adRP病例相關(guān)。PRPF參與前mRNA剪接，且已知參與纖毛發(fā)生和DNA損傷修復(fù)途徑。使用AAV相關(guān)的CRISPR-Cas9載體進(jìn)行基因增強(qiáng)，結(jié)果表明Prpf31基因增強(qiáng)可恢復(fù)小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的完整性。在Rpgr−/y Cas9+/WT小鼠中，使用sgRNA（Cas9）和AAV載體進(jìn)行Rpgr基因編輯可誘導(dǎo)光感受器的保存。

與adRP相關(guān)的RP1基因突變會(huì)破壞光感受器內(nèi)的蛋白質(zhì)運(yùn)輸、纖毛結(jié)構(gòu)的維持和視盤(pán)膜的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致光感受器細(xì)胞的死亡。最近，雙Cas9/sgRNA被證明可以成功降低編輯后的Hap1-EF1a-RP1細(xì)胞中的RP1表達(dá)，為進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)鋪平了道路。

4. 常染色體隱性連鎖突變

4.1. 視紫紅質(zhì)誘發(fā)的常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性

與adRP的遺傳形式類(lèi)似，許多RHO突變已被證明與經(jīng)典形式RP（例如adRP）相關(guān)，而只有少數(shù)與隱性形式相關(guān)。根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，adRP的RHO突變通常分為七類(lèi)。然而，只有五個(gè)RHO突變被證明與常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性（arRP）相關(guān)。與視紫紅質(zhì)相關(guān)的arRP的五個(gè)已知變體包括E150K、W161ter、E249ter和M2531突變。佳學(xué)基因檢測(cè)還在視力障礙患者中發(fā)現(xiàn)了與RHO相關(guān)的錯(cuò)義突變（E150K）。敲入小鼠模型表明，E150K 突變會(huì)損害視紫紅質(zhì)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致進(jìn)行性視網(wǎng)膜變性。這些觀(guān)察結(jié)果可以在基因解碼的幫助下，通過(guò)混亂的感光器盤(pán)結(jié)構(gòu)隨后損害正常的吞噬作用來(lái)解釋。純合 E150K 小鼠的視網(wǎng)膜中 Müller 細(xì)胞活化程度更高，巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞也更多，這為視網(wǎng)膜免疫激活提供了證據(jù)。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)無(wú)義突變（E249ter 和 W161ter）與 arRP 有關(guān)。使用轉(zhuǎn)染了視紫紅質(zhì)無(wú)義突變體的 HEK293 和 HT1080 人細(xì)胞系檢測(cè)到了較低水平的視紫紅質(zhì) mRNA，提示存在無(wú)義介導(dǎo)的衰變（NMD）；用已知的 NMD 抑制劑 Wortmannin 處理細(xì)胞，可恢復(fù)視紫紅質(zhì) mRNA 水平。M2531 視紫紅質(zhì)突變體被證實(shí)與 arRP 形式有關(guān)，來(lái)自土耳其近親血統(tǒng)的雜合子患者無(wú)癥狀 。佳學(xué)基因檢測(cè)進(jìn)一步研究以更好地了解常染色體隱性突變?cè)?RP 發(fā)展中的作用和影響。

4.2 非視紫紅質(zhì)相關(guān)常染色體隱性突變

基因解碼基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CNGB1基因的序列變異與常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性（arRP）有關(guān)，約占該病癥病例的4%。最近對(duì)CNGB1變異的基因檢測(cè)結(jié)果的綜合分析指出，共有62種遺傳變異與遺傳性視網(wǎng)膜疾病相關(guān)?；蚪獯a基因檢測(cè)表明，利用AAV載體恢復(fù)Cngb1−/−小鼠的CNGB1表達(dá)能夠改善視力，這些小鼠在視桿依賴(lài)性視覺(jué)引導(dǎo)行為測(cè)試中表現(xiàn)優(yōu)異 (pp.733–739)。此外，視網(wǎng)膜的變性速度顯著減緩，形態(tài)得以保持。

基因檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)，TULP1突變與早發(fā)性視網(wǎng)膜變性相關(guān)，盡管其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)，研究人員開(kāi)始關(guān)注使用斑馬魚(yú)模型來(lái)探討各種視網(wǎng)膜疾病的致病機(jī)制。他們建立了Tulp1表達(dá)的單敲除（Tulp1 +/−）和雙敲除斑馬魚(yú)模型，并發(fā)現(xiàn)下調(diào)微管成分tektin2會(huì)顯著影響纖毛的形成。通過(guò)AAV介導(dǎo)的TULP1基因表達(dá)編輯，成功恢復(fù)了TULP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平。然而，TULP1的基因表達(dá)恢復(fù)并不足以改善Tulp1 −/−小鼠的外核層厚度。

開(kāi)發(fā)新動(dòng)物模型用于基因治療是藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要途徑。最近，Beryozkin及其同事成功創(chuàng)建了Fam161a缺乏的小鼠模型，這些小鼠顯示出視網(wǎng)膜變性表型及增加的小膠質(zhì)細(xì)胞等分子生成標(biāo)記。同樣，純合Fam161a p.Arg512∗小鼠因外核層完全喪失和感光細(xì)胞死亡而出現(xiàn)視力改變。

RPGR基因已被證實(shí)與隱性RP相關(guān)，是研究最廣泛的基因之一。盡管AAV載體在治療方面顯示出良好的臨床前潛力，但研究者們?nèi)栽谔剿鞫喾N基因治療方法。最近的研究使用rd9小鼠模型，注射AAV引導(dǎo)的CRISPR-cas9載體，成功恢復(fù)了RPGR ORF15的閱讀框。

5 識(shí)別與視網(wǎng)膜色素變性有關(guān)的基因靶點(diǎn)，用于新型基因治療

為了開(kāi)發(fā)未來(lái)的基因療法，通過(guò)致病基因鑒定基因解碼識(shí)別與RP發(fā)病機(jī)制相關(guān)的新基因顯得尤為重要。針對(duì)大型患者隊(duì)列的基因測(cè)序研究為未來(lái)的基因靶點(diǎn)提供了重要線(xiàn)索。近年來(lái)，多個(gè)研究通過(guò)基因組測(cè)序揭示了可能與RP發(fā)病機(jī)制相關(guān)的多種基因。例如，佳學(xué)基因通過(guò)分析以色列和巴勒斯坦的遺傳性視網(wǎng)膜疾病病例，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的靶點(diǎn)：SLC66A1和SLC39A12 。其他SLC基因變體也與RP相關(guān)；SLC7A14基因敲除小鼠表現(xiàn)出視網(wǎng)膜變性和視覺(jué)功能障礙，表明該基因在視網(wǎng)膜發(fā)育中發(fā)揮重要作用。ATP/GTP結(jié)合蛋白的稀有雜合變體（如AGBL5的p.Arg281Cys和p.Arg487*）也可能與RP相關(guān)?？傮w而言，這些新基因在RP中的病理生理學(xué)仍需進(jìn)一步研究。關(guān)于導(dǎo)致視網(wǎng)膜疾病的基因及其定位位點(diǎn)的最新列表，可在《視網(wǎng)膜相關(guān)疾病及其基因突變位點(diǎn)列表》。

6 RNA替代療法

基因檢測(cè)與視網(wǎng)膜變性基因治療的研究正在不斷進(jìn)展，特別是在RNA替代療法方面。RNA替代療法的目標(biāo)是消除內(nèi)源性突變RNA，這一過(guò)程涉及非編碼RNA（ncRNA）的調(diào)控。ncRNA主要分為微小RNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）和短發(fā)夾RNA（shRNA）。其中，miRNA通過(guò)結(jié)合靶信使RNA（mRNA）的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾，從而抑制翻譯并導(dǎo)致mRNA的不穩(wěn)定。siRNA與miRNA有相似的作用機(jī)制，但其結(jié)合能力更為特異，可以識(shí)別單個(gè)核苷酸差異。shRNA在基因治療中則主要用于DNA遞送。

在視網(wǎng)膜色素變性（RP）的治療中，多個(gè)基因突變被發(fā)現(xiàn)與其發(fā)生相關(guān)。盡管目前尚無(wú)治愈RP的療法，研究者們正在開(kāi)發(fā)針對(duì)特定基因的藥物（如基因療法），以挽救細(xì)胞并支持人工視網(wǎng)膜的維持。

基因突變的作用機(jī)制和信號(hào)通路的研究為新藥的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。例如，通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)特定基因的編輯，能夠在模型生物中恢復(fù)視網(wǎng)膜功能。這些新發(fā)現(xiàn)為RP的治療開(kāi)辟了新的可能性。

總之，基因檢測(cè)和基因治療結(jié)合了最新的分子生物學(xué)技術(shù)，為治療遺傳性視網(wǎng)膜疾病帶來(lái)了新的希望。