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【佳學基因-基因檢測】核酸提取技術(shù)簡述(下)

? 【佳學基因-基因檢測】核酸提取技術(shù)簡述(下) 加醇沉淀 用醇沉淀的目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來,從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)主要是鹽的分離。就核酸而言,標準的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量,但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn),當裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后,單獨使用醇也可以使核酸沉淀

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佳學基因-基因檢測】核酸提取技術(shù)簡述(下)


 


加醇沉淀


用醇沉淀的目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來,從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽的分離。就核酸而言,標準的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量,但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn),當裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后,單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來;或者含有鹽,使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來,這樣的話,得率可能會降低。當碰到問題,判斷其主要是純度原因時,有效可以通過調(diào)整沉淀條件來改善。
 

 

洗滌


洗滌原理與目的: 洗滌是非常重要的,首先一定要將沉淀懸浮起來;第二就是要控制一定的時間,尤其是當核酸沉淀比較大時;第三是少量多次;第四則是去上清要有效。對于質(zhì)量好的離心管,上清可以去除得非常有效,否則其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗??梢酝ㄟ^倒掉液體后再短暫離心,將殘液用移液器吸出。

由于殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì),其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關。揮發(fā)時去掉的是乙醇,雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。另外,核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大,裂解液的裂解能力越強,洗滌越要有效:放置時間相對要長一點,洗滌次數(shù)也要考慮增加。當然,乙醇濃度的選擇也非常重要,一般情況,洗滌要用室溫的 75% 乙醇。

 

核酸溶解與保存


       核酸溶解: DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,其中原因是有人認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險。如果操作過程控制得當,DNase 的殘留幾乎是可以忽略的,有效可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。

核酸保存:基本上,核酸在保存中的穩(wěn)定性,與溫度成反比,與濃度成正比。一般在-20℃保存。如果溫度不合適,核酸發(fā)生降解或者消失,首要原因是酶殘留導致的酶解,第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導致的水解 ,RNA 在弱酸性更穩(wěn)定,而 DNA 在弱堿性更合適。
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(責任編輯:佳學基因)
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