【佳學(xué)基因檢測】如何對多發(fā)性骨髓瘤的基因序列變化進(jìn)行基因檢測?
多發(fā)性骨髓瘤患者樣本和 FACS
作為臨床常規(guī)的一部分,在佳學(xué)基因合作醫(yī)院收集了多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓樣本?;颊卟牧系氖占褪褂眯璜@得所在醫(yī)院倫理審查機構(gòu)的批準(zhǔn),并根據(jù)赫爾辛基宣言進(jìn)行。為了分析純化的細(xì)胞亞群,細(xì)胞使用 FACS ARIA IIu 分選儀 (BD Biosciences) 進(jìn)行 FACS。在分選過程采用碘化丙啶 (PI) 排除死細(xì)胞。使用 CD319 補償冷凍保存材料上 CD138 的損失,接受 FACS 的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞被分選為為 PI - CD14/CD16/CD11b - CD3 - CD319 + CD38 +. 此外,CD138、CD19、CD45 和 CD56 用于根據(jù)表達(dá)定義多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。接受 FACS 的粒細(xì)胞和 T 細(xì)胞的分選標(biāo)準(zhǔn)分別為 PI - CD14/CD16/CD11b + CD3 - CD19 - CD56 - CD319 - CD45 + CD38 -和 PI - CD14/CD16/CD11b - CD3 + CD19 - CD56 - CD319 - CD45 + CD38 -。
FISH基因檢測
使用針對 t(4;14)、t(14;16)、t(11; 14 )、 1q21、4p16、6q21、8p12、9p21、11q13、13q14、13q34、14q32 、 15q22、16q23、17p13 和 19q13的探針進(jìn)行FISH基因檢測。
lrWGS
在制備測序文庫時,將 200 至 240 個經(jīng)過 FACS 處理的細(xì)胞分選到 8 μL 含 2% 胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水中;將管短暫脈沖旋轉(zhuǎn),在干冰上冷凍,并儲存在-80°C直至使用。為了使細(xì)胞變性并使基因組 DNA 易于獲取,使用窄孔吸頭添加 2 μL 0.25N NaOH,并通過小心輕彈試管來混合樣品。在室溫下孵育 5 分鐘后,將 97.5 μL 樣品主混合物(89.5 μL 基因組試劑混合物、3 μL 添加劑 A 和 5 μL 基因組酶混合物;Chromium Genome Reagent Kit [v2 Chemistry])添加到具有窄孔先進(jìn)的變性細(xì)胞。隨后,使用大口徑吸頭輕輕移液混合樣品。將總共?? 90 μL 的樣品混合物(含有約 1.2 ng DNA)加載到 Chromium 基因組芯片上,其余步驟根據(jù)產(chǎn)品說明(手冊 CG00043 Rev B)執(zhí)行。使用 Qubit dsDNA HS 試劑盒(Invitrogen)對條形碼文庫進(jìn)行量化,合并,并使用 Illumina 平臺(Novaseq;Illumina,San Diego,CA)進(jìn)行配對末端測序(2×150 個循環(huán))。
使用 Long Ranger 處理數(shù)據(jù),輸出文件用于下游分析。簡而言之,染色體數(shù)是使用 BarCrawler ( https://github.com/J35P312/BarCrawler ) 結(jié)合內(nèi)部腳本計算的;對于選定樣本,還使用 ??CNVkit (v0.9.8)、 ASCAT (v2.5.2)、和 Battenberg 方法 (v2.2.9)評估了染色體數(shù)目;使用 FindSV ( https://github.com/J35P312/FindSV ) 和 Long Ranger 調(diào)用 CNV;體細(xì)胞變異調(diào)用是使用 nf-core/Sarek 分析方案(v2.6 ;使用 Strelka2 [v2.9.10] 和 Mutect2 [GATK v4.1.7.0] 作為獲得基因突變位置)和 VEP (v99.2) 和 SnpEff (v4.3t) 的組合用于變體注釋;使用 GROC-SV (v0.2.5) 結(jié)合 Long Ranger 識別 SV;并在Loupe和 IGV 中目視驗證SV。
RNA測序
鏈特異性 RNA 測序數(shù)據(jù)是從多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生成的。使用 STAR (v2.5.2b) 將測序數(shù)據(jù)與hg38進(jìn)行比對,使用 HOMER 量化外顯子中的46 個讀數(shù),使用 R 計算每百萬轉(zhuǎn)錄本 (TPM)。
ChipSeq
使用 H3K27Ac 抗體(批次 A1723-0041D/2;目錄號 #C15410196;Diagenode)對 20000 個用于FACS的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIPseq)。但對對照的制備進(jìn)行了微小修改。使用 bowtie2 將 Fastq 文件匹配到到hg38,并使用 HOMER、 DEseq2和 R 進(jìn)行下游分析。
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