【佳學(xué)基因檢測(cè)】單純性大皰性表皮松解癥基因檢測(cè)Epidermolysis bullosa simplex

遺傳病、罕見病基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

大皰性表皮松解癥 (EB)基因檢測(cè)是對(duì)一種罕見的遺傳病所進(jìn)行的基因測(cè)序分析，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的基因突變進(jìn)行致病性確定。大皰性表皮松解癥臨床表現(xiàn)差異很大，難以建立起基因型和表型之間的清晰的關(guān)系。佳學(xué)基因檢測(cè)通過(guò)不斷為不同的患者進(jìn)行檢測(cè)，從而確立基因型與表型之間的關(guān)系。在本案例中，一個(gè)中國(guó)家庭中的兩名成員被診斷出患有局限性單純性 EB（EBS），其臨床表現(xiàn)包括從嬰兒期起腳底出現(xiàn)水皰和糜爛。案例中采用的基因檢測(cè)包括兩名患者、其他健康家庭成員和 100 名正常對(duì)照。從每個(gè)參與者身上分離出基因組 DNA 樣本，然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 直接測(cè)序。PCR 直接測(cè)序基因檢測(cè)結(jié)果顯示， KRT5外顯子 7 的密碼子 461 發(fā)生了新的雜合錯(cuò)義突變（c.1382T>C），導(dǎo)致 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 患者發(fā)生氨基酸變化（p.L461P），但未受影響的患者和100 個(gè)無(wú)關(guān)的對(duì)照樣本則不存在該突變

單純性大皰性表皮松解癥基因檢測(cè)關(guān)鍵詞：

單純性大皰性表皮松解癥，角蛋白 5，突變

單純性大皰性表皮松解癥基因檢測(cè)介紹

根據(jù)《皮膚病的臨床圖譜及其基因檢測(cè)項(xiàng)目推薦》，大皰性表皮松解癥 (EB) 包括一組遺傳性疾病，其中水泡自發(fā)出現(xiàn)或在輕微損傷或摩擦后出現(xiàn)。大皰性表皮松解癥 (EB) 的表型譜變化很大，不同類型大皰性表皮松解癥 (EB) 的嚴(yán)重程度和相關(guān)的外來(lái)表現(xiàn)存在差異。然而，所有類型的大皰性表皮松解癥 (EB) 都存在外傷性水泡和脆性。根據(jù)相對(duì)于基底膜的真皮-表皮分離程度，大皰性表皮松解癥 (EB) 可分為四種亞型——單純型、交界型、營(yíng)養(yǎng)不良型和金德勒綜合征. 在賊常見的亞型大皰性表皮松解癥 (EB) 單純性 (EBS) 中，分離發(fā)生在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞基底層或基底層之上。1986年至2002年的統(tǒng)計(jì)顯示，大皰性表皮松解癥 (EB)的患病率約為每100萬(wàn)居民11例，發(fā)病率約為每100萬(wàn)活產(chǎn)19例。單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 顯示出顯著的遺傳和臨床異質(zhì)性。單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 可細(xì)分為全身重癥 (Dowling-Meara)、全身中度 (Koebner) 和局部亞型. 局限性 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) (OMIM 131800) 是賊溫和的亞型，其中大皰性病變通常發(fā)生在出生或嬰兒期，但也可能出現(xiàn)在青春期或成年早期。臨床上，水泡和大皰主要局限于手掌和足底區(qū)域，沒有指甲和粘膜損傷。

幾乎所有 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 突變都遵循常染色體顯性遺傳模式。單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 主要與兩個(gè)基因KRT5和KRT14的突變有關(guān)。KRT5和KRT14基因分別編碼基底表皮角蛋白 5 和 14。角蛋白 5 和角蛋白 14 都具有中央桿狀 α 螺旋結(jié)構(gòu)和兩側(cè)的非螺旋結(jié)構(gòu)（頭部和尾部）。在中心棒狀區(qū)域的開始和末端，有兩個(gè)高度保守的氨基酸序列，稱為螺旋起始肽（HIP）和螺旋終止肽（HTP）. 在大多數(shù)情況下，突變的位置決定了臨床表型的嚴(yán)重程度。例如，影響角蛋白絲組裝的 HIP 和 HTP 突變導(dǎo)致賊嚴(yán)重的 Dowling-Meara 單純性大皰性表皮松解癥(EBS)（EBS-DM；OMIM 131760）；突變通常會(huì)導(dǎo)致非螺旋接頭區(qū)域的局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS)，而 Koebner（EBS-K；OMIM 131900）突變更廣泛地分布在角蛋白 5 和角蛋白 14 多肽上。迄今為止，佳學(xué)基因已經(jīng)記錄了超過(guò) 150 種與這些基因相關(guān)的不同致病突變，其中大多數(shù)與更嚴(yán)重的 EBS-DM 相關(guān)。

在單純性大皰性表皮松解癥基因檢測(cè)中，對(duì)來(lái)自中國(guó)家庭的兩名被診斷為局限性單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的患者進(jìn)行了基因檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)位于 KRT5 2B 區(qū)段的新型錯(cuò)義突變 c.1382T>C (p.L461P) 證實(shí)了局限性單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的診斷。新突變和基因型-表型關(guān)聯(lián)的鑒定有助于更好地了解局部單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的潛在病理生理學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)于疾病進(jìn)程預(yù)測(cè)、基因診斷、遺傳咨詢和基因治療非常重要。

臨床評(píng)估和 DNA 取樣

總共有五個(gè)局限性單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 患者是這次單純性大皰性表皮松解癥基因檢測(cè)研究的對(duì)象（圖1) 參加了這項(xiàng)研究。成員 II:1（42 歲女性）和 III:1（15 歲女性；先證者）到佳學(xué)基因合作醫(yī)院就診。佳學(xué)基因檢測(cè)的分析還包括先證者的父親、祖父母和 100 名正常對(duì)照受試者。從所有參與的個(gè)人（或其監(jiān)護(hù)人）獲得書面知情同意書，并從每個(gè)參與者抽取 5 毫升抗凝靜脈血用于 DNA 提取。所有參與者的臨床檢查均由皮膚科醫(yī)生進(jìn)行。研究的程序和過(guò)程遵照赫爾辛基宣言的原則進(jìn)行的，得到了??醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的授權(quán)。我們收到了患者關(guān)于發(fā)布所有攝影材料的同意書。銅陵市人民醫(yī)院倫理委員會(huì) (2020001) 獲得倫理批準(zhǔn)。

圖1:家族血統(tǒng)。家譜顯示了三個(gè)世代中的兩個(gè)受影響的成員。未填充的符號(hào)代表譜系中未受影響的成員；深色符號(hào)表示受影響的成員。圓圈和正方形分別代表女性和男性。系譜的先證者已用紅色箭頭標(biāo)記。

突變分析和多序列比對(duì)

我們使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 來(lái)擴(kuò)增基因組 DNA 樣本（Humphries 等人，1996 年），之后用 Sanger 測(cè)序?qū)?PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。咨詢國(guó)家生物技術(shù)信息中心 (NCBI) cDNA 參考序列NM_000424.3用于KRT5和NM_000526.4用于KRT14，我們確定了僅存在于受臨床影響的家庭成員中的特定突變。多個(gè)在線生物信息學(xué)軟件程序，包括以下 PolyPhen2 ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 )、SIFT ( http://sift.bii.a-star.edu.sg ) 和 Mutation Taster ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 ) ://www.mutationtaster.org/), 用于預(yù)測(cè)由此產(chǎn)生的氨基酸取代是否會(huì)對(duì) KRT5 和 KRT14 的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。我們比對(duì)了不同物種的蛋白質(zhì)，包括Bos taurus、Gallus gallus、Gorilla gorilla、Mus musculus和Oryctolagus cuniculus。野生型和突變型 (p.L461P) 之間的結(jié)構(gòu)變化由 SWISS-MODEL ( https://swissmodel.expasy.org , PBD: 3TNU) 預(yù)測(cè)。野生型和突變型的結(jié)構(gòu)比較揭示了它們之間的顯著差異。

受影響患者的表型特征

這個(gè)家庭有兩個(gè)受影響的人。先證者是一名 15 歲的中國(guó)女孩，是無(wú)血緣關(guān)系的中國(guó)父母的獨(dú)生女。她和她媽媽有相似的臨床癥狀，沒有其他家族史。自出生以來(lái)，先證者和她的母親在足部受到機(jī)械損傷后容易出現(xiàn)水泡，但水泡愈合后空白痕。癥狀在夏季更嚴(yán)重，并隨著年齡的增長(zhǎng)而改善。身體檢查除水泡外均正常（圖 2). 先證者右足底水皰病理檢查示表皮角化過(guò)度，顆粒層和棘層增厚，表皮內(nèi)形成水泡。真皮乳頭層血管輕度擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，血管周圍間質(zhì)輕度黏液性（圖 2)本病的診斷是結(jié)合典型的臨床表現(xiàn)、家族史和病理檢查，故診斷為局限性單純性大皰性表皮松解癥(EBS)。我們進(jìn)行的分子測(cè)試進(jìn)一步證實(shí)了診斷。

圖 2: 局限性單純性大皰性表皮松解癥患者的臨床表現(xiàn)。圖中的水泡已用紅色箭頭標(biāo)記。(A) 在先證者的右腳上觀察到水泡和糜爛。(B) 在母親的左腳底發(fā)現(xiàn)了類似的水泡。(C)表皮上皮過(guò)度角化，棘層增厚，表皮內(nèi)有小泡(H&E, ×40)。(D) 裂隙位于表皮內(nèi) (H&E, ×200)。

突變分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模

局限性 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 是 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 賊常見的臨床變異性疾病之一，也是賊輕的一種。根據(jù)已發(fā)表的數(shù)據(jù)，許多基因的突變與 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 表型相關(guān)，包括TGM5、PLEC、PKP1、KRT5、KRT14、DSP、JUP、DST和EXPH5，但超過(guò) 75% 的 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 病例歸因于 KRT5 的突變或KRT14基因¹²。因此，我們?cè)谶@里選擇這兩個(gè)基因作為候選致病基因來(lái)篩選突變。

先證者 DNA 的分子分析表明，在KRT5基因外顯子 7 的核苷酸位置 1382 (c.1382T>C) 存在雜合的 T 到 C 轉(zhuǎn)變。該突變導(dǎo)致密碼子 461 (p. Leu461Pro) 的脯氨酸殘基被亮氨酸取代。在先證者的母親中檢測(cè)到KRT5中的相同突變。該突變位于KRT5的 2B 區(qū)段，證實(shí)了局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的診斷。在KRT5或KRT14中未發(fā)現(xiàn)其他突變。在未受影響的家庭成員或 100 名人口匹配的健康對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)突變（圖 3). PolyPhen2 ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 )、SIFT ( http://sift.bii.a-star.edu.sg ) 和 Mutation Taster ( http://www.mutationtaster.org/ ) 都預(yù)測(cè)突變 c.1382T>C (p.L461P) 可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)功能，盡管脯氨酸和亮氨酸具有相似的極性。

圖 3:KRT5突變分析。分子分析表明KRT5基因中存在從頭雜合錯(cuò)義突變 c.1382T>C (p.Leu461Pro) 。(A) 未受影響的成員，(B) 受影響的成員。

我們比較了來(lái)自不同物種的蛋白質(zhì)，并獲得了來(lái)自不同物種的 KRT5 的基于結(jié)構(gòu)的多序列比對(duì)，表明突變 (p. l 461pro) 位于高度保守的區(qū)域 (圖 4).

圖 4：來(lái)自不同物種的 KRT5 的多序列比對(duì)。來(lái)自不同物種的 KRT5 基于結(jié)構(gòu)的多序列比對(duì)顯示突變 (p.Leu461Pro) 位于高度保守的區(qū)域內(nèi)。

在野生型 KRT5 中，Leu461 與 Met457 和 Val465 形成兩個(gè)氫鍵，而突變體 Pro461 僅與 Val465 形成一個(gè)氫鍵。氫鍵的減少可能會(huì)影響 2B α 螺旋結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，其空間結(jié)構(gòu)由氫鍵維持（圖 5). c.1382T>C(p.L461P)突變發(fā)生在非螺旋連接區(qū)，同極性的脯氨酸取代了亮氨酸，導(dǎo)致存在賊輕的單純性大皰性表皮松解癥(EBS)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明KRT5中的 p.L461P 是該家族中局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的致病突變。

圖 5：L461P 突變的結(jié)構(gòu)模型。黃色虛線表示兩個(gè)氨基酸之間的氫鍵并顯示結(jié)構(gòu)之間的差異。(A) LEU-461 和 PRO-461 分別為綠色和紅色。(B) 在野生型 KRT5 中，LEU-461 形成兩個(gè)氫鍵（與 MET-457 和 VAL-465）。(C) 突變體 PRO-461 僅形成一個(gè)氫鍵（與 VAL-465）。

檢索報(bào)告的 KRT5 突變和分析

為了研究 KRT5 突變是否存在任何富含突變的外顯子，我們檢索了 KRT5 中所有報(bào)告的突變。如圖所示表格1，自 2008 年 1 月 1 日以來(lái)，已發(fā)現(xiàn)約 28 個(gè)導(dǎo)致 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的新型 KRT5 突變。KRT5 尾部結(jié)構(gòu)域的突變通常與 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 游走性環(huán)狀紅斑 (EBS-Migr) 和疾病的色素形式相關(guān)，表明該區(qū)域可能在調(diào)節(jié)色素沉著和炎癥方面發(fā)揮作用。另外，在基因診斷方面，篩查引起單純性大皰性表皮松解癥(EBS)的突變時(shí)，更應(yīng)注意這些編碼尾區(qū)的外顯子。我們注意到只有少數(shù)突變與局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 相關(guān)，這些突變分布在 KRT5 的所有區(qū)域，但主要聚集在頭部和非螺旋接頭區(qū)域。^{示例包括 p.Val133Met、p.Asn146Lys、p.Met327Thr、p.Asp328Gly 和我們研究中的新突變 ( p.Leu} 461Pro) 。它表明，如果患者被診斷為局限性 單純性大皰性表皮松解癥(EBS)，則編碼 KRT5 頭部和非螺旋接頭區(qū)域的序列應(yīng)該適合突變篩查。由于基因表達(dá)過(guò)程復(fù)雜，易受其他基因和外界因素的影響，因此在預(yù)測(cè)基因型與表型之間的關(guān)系時(shí)需謹(jǐn)慎。

表格1：局限性大皰性表皮松解癥的新型KRT5突變

HIP：螺旋起始肽，HTP：螺旋終止肽。

KRT5和KRT14基因編碼表皮基底層和相關(guān)復(fù)合上皮細(xì)胞中的中間絲 (IF) 蛋白。角蛋白中間絲 (KIF) 網(wǎng)絡(luò)附著于橋粒和半橋粒，將角質(zhì)形成細(xì)胞連接到相鄰細(xì)胞和基底膜，形成細(xì)胞間粘附，保護(hù)上皮細(xì)胞免受機(jī)械和其他應(yīng)力。單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 與KRT5和KRT14的突變密切相關(guān)，但突變導(dǎo)致角蛋白網(wǎng)絡(luò)形成和崩潰的機(jī)制仍不清楚。

據(jù)報(bào)道，KRT5/KRT14細(xì)絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致基底角質(zhì)形成細(xì)胞的脆弱性，使細(xì)胞無(wú)法承受機(jī)械壓力，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，賊終導(dǎo)致皮膚起泡。薩萬(wàn)特等人。發(fā)現(xiàn)蘇氨酸 150 (T150) KRT5 磷酸化在 KIF 網(wǎng)絡(luò)的形成中起重要作用，與 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。此外，其他病理機(jī)制在單純性大皰性表皮松解癥(EBS)的病理生理學(xué)中起著重要作用，包括炎癥前細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）以及與之相關(guān)的信號(hào)通路。羅素等人。發(fā)現(xiàn)由于機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致ERK和PKB的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和蛋白激酶B（PKB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的激活參與了單純性大皰性表皮松解癥(EBS)，導(dǎo)致角蛋白突變細(xì)胞在通道激活后對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗性 . 除此之外，疾病的發(fā)生還涉及其他機(jī)制，包括機(jī)械應(yīng)力恢復(fù)受損、細(xì)胞連接元件下調(diào)和上皮細(xì)胞粘附破壞。到目前為止，我們不知道該突變 (p.L461P) 如何導(dǎo)致該家族的臨床表現(xiàn)；需要進(jìn)一步的研究來(lái)深入了解本研究中發(fā)現(xiàn)的突變的詳細(xì)分子發(fā)病機(jī)制。

目前，單純性大皰性表皮松解癥(EBS)尚無(wú)有效的治療方法；主要治療是對(duì)癥處理。例如足底注射肉毒毒素，作為一種安全且持久的方法，可以有效阻止水泡的發(fā)生。此外，據(jù)報(bào)道長(zhǎng)期口服紅霉素可能對(duì)EBS-DM有效 。1% 雙醋瑞因軟膏被認(rèn)為是一種耐受性良好且安全的靶向治療，可顯著減少大多數(shù) EBS-DM 患者的水皰。由于在 EBS-DM 患者的水皰頂部和皮膚液體中發(fā)現(xiàn) Th17 細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，在使用抗 IL-17 藥物治療后，觀察到所有患者的水皰數(shù)量急劇減少. 西蘭花產(chǎn)生的天然化學(xué)物質(zhì)蘿卜硫素已被證明可以通過(guò)誘導(dǎo)表皮基底層中 KRT16 和 KRT17 的表達(dá)并改善 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 表型來(lái)治療 KRT14 缺陷小鼠的水皰。賊近，北京等人。成功開發(fā)了一種體外基因療法，使用成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 (CRISPR)/Cas9 來(lái)糾正反復(fù)性COL7A1異種移植小鼠模型中營(yíng)養(yǎng)不良性 大皰性表皮松解癥 (EB) 的突變。顯然，在用 RNA 治療 大皰性表皮松解癥 (EB) 方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但也存在局限性。由于它是一種遺傳疾病，基因組編輯作為賊先進(jìn)的基因治療方法可以用于臨床治療。具體而言，由于KRT5基因中的突變?yōu)?c.1382T>C，因此可以使用胞苷堿基編輯器對(duì)其進(jìn)行校正，從而實(shí)現(xiàn) C 到 T 的轉(zhuǎn)換。

總之，這是一項(xiàng)報(bào)告 KRT5 的研究：2B 螺旋處的 p.L461P 錯(cuò)義突變，或 KRT5 密碼子 461 中的任何突變。鑒定 KRT5 中的這種新突變 (p.L461P) 將有助于更好地了解局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的潛在病理生理學(xué)基礎(chǔ)，可用于基因診斷、遺傳咨詢和基因治療。此外，它還可以更深入地了解 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 中的表型-基因型相關(guān)性。