【佳學(xué)基因檢測】如何采用液體活檢檢進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測與NGS測序

采用液基細(xì)胞學(xué)處理后，使用Ion Torrent® Genexus®系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）進(jìn)行了Oncomine®精密和全面腫瘤固體檢測面板（賽默飛世爾科技，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）的下一代測序。腫瘤基因解碼基因檢測根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行處理：從液基細(xì)胞學(xué)樣本中獲取細(xì)胞，獲得細(xì)胞沉淀和刮取的細(xì)胞：刮取細(xì)胞時，移除蓋玻璃，將載玻片放入丙酮中直到脫落。接著，依次將載玻片放入丙酮/二甲苯混合液（1:1）中5分鐘，放入二甲苯中5分鐘，放入100%的乙醇中5分鐘，然后在室溫下晾干。腫瘤細(xì)胞被刮取并放入裝有消化緩沖液的1.5毫升管中。從液基細(xì)胞學(xué)樣本中獲取細(xì)胞沉淀，將其放入無菌的50毫升離心管中，然后離心5分鐘，速度為3000 rpm。棄去上清液，向沉淀物中添加1毫升的先進(jìn)酒精。然后，將混合物放入1.5毫升管中，進(jìn)行新的離心以去除上清液。賊后，將沉淀物在室溫下晾干，直到溶劑蒸發(fā)完畢，然后添加消化緩沖液。使用MagMax™ FFPE DNA/RNA Ultra檢測試劑盒（賽默飛世爾科技，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）進(jìn)行DNA和RNA的雙重提取。根據(jù)需要，使用Qubit Flex與Qubit 1x ds DNA HS測定套件和Qubit RNA HS測定試劑盒（賽默飛世爾科技，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）進(jìn)行DNA和RNA濃度的熒光定量。根據(jù)Oncomine®精密腫瘤固體檢測面板對細(xì)胞學(xué)樣本的建議，DNA的賊佳輸入量為0.67 ng/μL。準(zhǔn)備液基細(xì)胞學(xué)DNA樣本（1.1毫升）。剩余的液基細(xì)胞學(xué)樣本存儲在-80°C備用。DNA面板Oncomine®全面腫瘤固體檢測面板用于識別熱點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異（CNVs）（42）和融合變異，也可以識別全長基因。DNA面板Oncomine®精密腫瘤固體檢測面板用于識別熱點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異（CNVs）（14）和融合變異。使用Ion reporter 5.18軟件進(jìn)行NGS分析，以下是質(zhì)控（QC）閾值：對于單核苷酸分子變異（SNV/Indel），覆蓋率必須至少為2，賊低檢測截止頻率為0.035%和0.05%。進(jìn)行拷貝數(shù)變異（CNV）調(diào)用，必須滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：平均先進(jìn)成對差（MAPD）< 0.5，p值< 10-5，拷貝數(shù)增加的CNV比例必須大于1.15，一次拷貝數(shù)減少的CNV比例應(yīng)小于0.85。

近幾十年來，兒童癌癥的見效率已經(jīng)增加到約80%，但在發(fā)達(dá)國家，癌癥仍是一歲以上兒童疾病導(dǎo)致的主要死因。此外，許多幸存的癌癥兒童會因手術(shù)、細(xì)胞毒性化療和放射治療的長期后遺癥，包括精神殘疾、器官毒性和二次癌癥而受苦。開發(fā)更具特異性和損傷性更小的治療方法的關(guān)鍵步驟是解開兒科惡性腫瘤的完整基因譜系，這些腫瘤在組織病理學(xué)實(shí)體和分子亞型上不同于成人惡性腫瘤。過去幾年，已經(jīng)啟動了許多針對特定疾病的測序工作，但迄今為止的幾項(xiàng)兒科泛癌癥研究只關(guān)注突變頻率、遺傳易感性和表觀遺傳調(diào)控因素的改變。

腫瘤基因解碼對兒童、青少年和年輕人的癌癥進(jìn)行了廣泛的探索，包括在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞水平上進(jìn)行的小突變以及拷貝數(shù)或結(jié)構(gòu)變異，并通過確定潛在的癌癥基因并將其與癌癥基因圖譜（TCGA）先前在成人癌癥中報(bào)道的基因進(jìn)行比較。腫瘤基因解碼還研究了突變信號和潛在的藥物靶點(diǎn)。

這項(xiàng)整合性分析包括24種類型的癌癥，涵蓋了所有主要的兒童癌癥種類，其中許多僅在兒童中出現(xiàn)。腫瘤基因解碼研究中的95%的病人在兒童或青少年時期（18歲或以下）被診斷，5%為年輕成人（賊多25歲）。腫瘤基因解碼研究偏向于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，另一項(xiàng)研究對主要有白血病和顱外實(shí)體腫瘤的非重疊兒科隊(duì)列進(jìn)行了補(bǔ)充。

腫瘤基因檢測整合了961個腫瘤（914個單獨(dú)的患者）的雙端Illumina基礎(chǔ)測序數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來自之前的癌癥類型特定的研究，包括547個全基因組序列（WGS，中位覆蓋率37×）和414個全外顯子序列（WES，121×），部分由低覆蓋率全基因組補(bǔ)充。腫瘤和匹配的生殖細(xì)胞樣本通過標(biāo)準(zhǔn)化的管道處理，以檢測單核苷酸變異（SNVs）、短插入和缺失（indels）、拷貝數(shù)變異（CNVs）和其他結(jié)構(gòu)變異。二次（反復(fù)）腫瘤（n = 82，包括47個與原發(fā)匹配）與主要的原發(fā)隊(duì)列（n = 879）分開進(jìn)行分析。

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