【佳學(xué)基因檢測儀器】高密度芯片掃描儀HiScan
高密度芯片掃描儀Iscan是由由美國Illumina,在中國稱為因美納公司出產(chǎn)的一種大容量單核苷酸分型基因檢測儀器設(shè)備系統(tǒng)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在單個的核苷酸上發(fā)生變異而引起的DNA序列多態(tài)性,多為轉(zhuǎn)換和顛換兩種。一般來說,一個 SNP 位點(diǎn)只有兩種等位基因,而檢測這一對等位基因類型的技術(shù)則被稱為基因分型( genotyping)??傮w來說,編碼區(qū)的SNP較非編碼區(qū)的少的多。編碼區(qū)SNP可分為兩種:一種是同義SNP (synonymous SNP),即SNP引起的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列;另一種是非同義cSNP (non-synonymous SNP),指堿基序列的改變可使以其翻譯的蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生改變。后者往往引起性狀改變、疾病發(fā)生等。
在人類基因組中大概每1000 個堿基就有一個SNP,人類基因組上的SNP總量大概是3×10E7個,構(gòu)成了人類遺傳多樣性的90%。已知許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都與SNP有關(guān)。大量存在的SNP位點(diǎn),使我們有機(jī)會發(fā)現(xiàn)與各種疾病,包括腫瘤相關(guān)的基因;有些SNP并不直接導(dǎo)致疾病基因的表達(dá),但由于它與某些疾病基因相連鎖,而成為重要的標(biāo)記。SNP在基礎(chǔ)研究中也有很好的應(yīng)用,通過分析特定染色體或基因的SNP,能夠?qū)θ后w遷徙、演化等進(jìn)行研究。SNP提供了一個強(qiáng)有力的工具,用于群體遺傳學(xué)研究(生物進(jìn)化、遺傳分析) 、疾病相關(guān)基因研究(復(fù)雜疾病的易感性基因分析與基因定位) 、環(huán)境因子易感基因的檢出與病原體基因分析 、藥物基因組學(xué)(藥物開發(fā)與個體用藥)、個體識別與法醫(yī)鑒定 、生物醫(yī)藥研究(系統(tǒng)發(fā)育分析與病理分子遺傳機(jī)理闡明)等領(lǐng)域。
目前研究SNP的技術(shù)多種多樣,其中常用的包括測序技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)、HRM技術(shù)、Taqman技術(shù)以及SNP芯片技術(shù)。今天給大家介紹下常用的昂飛和Illumina公司的SNP芯片。
Affymetrix 公司是一家專業(yè)做芯片的高科技公司,其率先開發(fā)的半導(dǎo)體原位光刻專利技術(shù),是生產(chǎn)高密度寡核苷酸基因芯片的核心關(guān)鍵技術(shù),該方法的賊大優(yōu)點(diǎn)在于用很少的步驟可合成大量的 DNA 陣列。靈活性的定制服務(wù),位點(diǎn)密度高達(dá)260萬。可對任何物種、任何基因組規(guī)模和任何倍性物種進(jìn)行基因分型。其SNP檢測芯片主要基于GENEChip平臺的人SNP 6.0 芯片和基于GeneTitan平臺的Axiom基因分型芯片。分為目錄芯片和定制芯片服務(wù),提供人、牛、水牛、雞等目錄芯片,以及定制化芯片,為客戶提供多重選擇。以SNP6.0系列為例,其一半以上是無偏選擇的SNP,此外還包括有Tag SNP、線粒體SNP、性染色體SNP和重組熱點(diǎn)位置的SNP。
昂飛芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)流程如下:
1)DNA樣品準(zhǔn)備:測定DNA濃度,并統(tǒng)一調(diào)整為一致的濃度;
2)DNA擴(kuò)增:將樣本DNA變性為單鏈,之后加入全基因組擴(kuò)增試劑,恒溫條件下過夜孵育,擴(kuò)增后的DNA總量可達(dá)初始上樣量的2000-3000倍;
3)DNA片段化:擴(kuò)增后的產(chǎn)物,經(jīng)過酶切成為片段化的DNA;
4)DNA純化:沉淀DNA片段,沉淀后的DNA在空氣中干燥后,加入雜交緩沖試劑使DNA沉淀重新溶解;
5)芯片的掃描:將處理樣品加入芯片置于掃描儀中,雜交洗滌掃描一站式服務(wù),掃描儀獲取由熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光,并生成高分辨率的圖片。數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入 ConsoleTM 軟件進(jìn)行分析,從而得到每個樣本的 SNP 位點(diǎn)信息。
Illumina公司的 Infinium基因分型平臺和 GoldenGate基因分型平臺是目前在人類醫(yī)學(xué)以及農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域應(yīng)用賊為廣泛的基因分型平臺之一。這兩個基因分型平臺都采用微珠芯片分型技術(shù),憑借其高效的數(shù)據(jù)檢出率、簡便的操作流程能同時完成數(shù)千個樣本的基因分型。在平臺硬件設(shè)施上,主要使用 iScan 掃描儀對各分型芯片進(jìn)行掃描。全基因組分型芯片能夠在全基因組水平掃描基因組中的 SNP 及結(jié)構(gòu)變異,并提供細(xì)胞遺傳學(xué)解決方案。定制芯片能夠有效根據(jù)研究需要挑選變異位點(diǎn),并定制探針完成這些位點(diǎn)的基因分型。其優(yōu)勢是重復(fù)性高:①再現(xiàn)性大于 99.9%;②成功率高:平均 call rate 大于99%;③正確性好:孟德爾遺傳錯誤率小于0.1%。
Illumina基因分型芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)流程如下:
1)DNA 樣品準(zhǔn)備:測定 DNA 濃度,調(diào)整至一致的濃度;
2)DNA 擴(kuò)增:將樣本 DNA 變性為單鏈,加入全基因組擴(kuò)增試劑,恒溫條件下過夜孵育,擴(kuò)增后的 DNA 總量可達(dá)初始上樣量的 2000-3000 倍;
3)DNA 片段化:擴(kuò)增后的DNA經(jīng)過打斷處理成為片段化的DNA;
4)DNA 純化:沉淀DNA片段,干燥后,加入雜交緩沖試劑使DNA沉淀重新溶解;
5)DNA 與芯片的雜交:將純化后的DNA 樣本與準(zhǔn)備好的芯片雜交,置于雜交爐內(nèi)反應(yīng)過夜。雜交過程中,片段化DNA變性,與位點(diǎn)特異的探針退火結(jié)合;
6)單堿基延伸:洗去未雜交的和非特異雜交的 DNA。以捕獲到的 DNA 為模板,在芯片上進(jìn)行單堿基的延伸反應(yīng),加上可檢測的標(biāo)簽基團(tuán),從而區(qū)分樣本的 SNP 類型;
7)芯片包被:將反應(yīng)完成的芯片表面包裹上一層粘性透明液體,放入真空環(huán)境下干燥 1 小時,從而將芯片包被,保護(hù)其信號穩(wěn)定較長的時間;
8)芯片掃描:將處理好的芯片放入iScan掃描儀中,掃描儀獲取由熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光,生成高分辨率的圖片。圖片導(dǎo)入軟件進(jìn)行分析,得到每個樣本的SNP位點(diǎn)熒光信號。
標(biāo)準(zhǔn)信息分析主要包括數(shù)據(jù)質(zhì)控和數(shù)據(jù)產(chǎn)出評估與SNP calling。數(shù)據(jù)質(zhì)控分為樣品水平質(zhì)控和SNP水平質(zhì)控。在得到分型的原始數(shù)據(jù)之后,需要對這些原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,以高效我們提交給您的數(shù)據(jù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn),同時也確保后續(xù)進(jìn)行其他分析的數(shù)據(jù)的正確性。SNP calling主要包括SNP call rate 過濾,位點(diǎn)信號分布質(zhì)量、哈溫平衡。
高級信息分析主要包括缺失數(shù)據(jù)處理、關(guān)聯(lián)分析等內(nèi)容。根據(jù)客戶需要提供GWAS、遺傳圖譜構(gòu)建、群體結(jié)構(gòu)分析、群體進(jìn)化分析等分析內(nèi)容。
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