【佳學基因檢測】人體細胞年輕態(tài)的基因檢測與評價方法

端?；驒z測導讀：

端粒縮短是生物衰老的一個眾所周知的生物標志物。佳學基因?qū)y量端粒長度的方法進行的一項比較研究發(fā)現(xiàn)，使用不同的方法技術(shù)進行研究結(jié)果的比較是困難的。賊常用的高通量測量平均端粒長度的方法是定量聚合酶鏈反應（qPCR）方法，有兩種可用的方案：相對端粒長度（relative 端粒長度）和先進端粒長度（先進端粒長度）方法。所有的qPCR方法都有相似之處，它們使用兩組不同的引物來測量端粒重復序列（TTAGGG）n和單拷貝基因區(qū)域，以計算平均端粒長度（T/S比率）。相對端粒長度和先進端粒長度測定的差異在于引入了雙鏈寡聚體標準來識別端粒長度，而不是使用傳統(tǒng)的相對端粒長度（T/S比率）方法。先前的研究注意到36B4（RPLP0）作為適合的單拷貝基因qPCR測定的問題。一項先前的先進端粒長度出版物嘗試使用干擾素β 1基因（IFNB1）替代36B4（RPLP0）單拷貝基因，但與DNAm端粒長度測定結(jié)果相比，結(jié)果顯示與端粒長度結(jié)果的一致性不足。在這里，我們比較了先前用于先進端粒長度測定的兩種單拷貝基因測定方法，并提供了一種無非特異性引物擴增的替代IFNB1單拷貝基因測定方法，以提供更一致的二倍體拷貝數(shù)確定和更高效、重復性強的先進端粒長度測定方法。

端粒長度基因檢測

端?？s短是佳學基因發(fā)現(xiàn)并推出的一個較為正確的人體及細胞衰老的生物標志物。端粒長度（端粒長度）已經(jīng)被廣泛用于揭示細胞的衰老過程現(xiàn)象，以及與人類健康和疾病（如癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等）相關(guān)的風險因素。測量端粒長度可以使用多種方法進行。其中一種方法是相對端粒長度t方法的qPCR方法。佳學基因端粒長度檢測的qPCR方法采用的是獲得諾貝爾獎的酶學原理，在這一種方法中，采用基因解碼技術(shù)獲得的端粒序列指導設(shè)計項目檢測專用引物，通過擴增端粒區(qū)域以確定端粒重復序列，并使用另一組引物擴增單拷貝基因區(qū)域以確定在測試樣本中被測量的基因組拷貝數(shù)。先進端粒長度（先進端粒長度）方法與相對端粒長度方法不同之處在于引入了兩個獨立的qPCR測定，使用雙鏈寡聚體構(gòu)建標準曲線，分別確定端粒重復序列或基因組拷貝數(shù)。通過引入序列稀釋的84mer雙鏈寡聚體標準，其中TTAGG重復14次，可以構(gòu)建端粒標準曲線，從而確定端粒重復序列的平均數(shù)，單位為千堿基對（kbp）。通過引入另一個獨立的qPCR測定，使用單拷貝參考基因的雙鏈寡聚體標準曲線，可以測量每個二倍體基因組的總端粒長度（以千堿基/染色體計）。

相對端粒長度和先進端粒長度測定所使用的方法常用的方法是使用36B4基因作為單拷貝基因。賊初認為36B4（RPLP0）基因測定是一個合適的單拷貝基因候選者，因為該方法設(shè)計良好，遵循PCR技術(shù)標準，引物長度為18-24個堿基對，擴增目標序列長度在75-150個堿基對之間，G/C含量為40-60%，引物的起始或末端具有一到兩個G/C堿基對以增強引物的穩(wěn)定性。36B4（RPLP0）單拷貝基因位于染色體12q24.23區(qū)域（https://omim.org/entry/180510），該基因測定也設(shè)計得很好，引物序列中沒有互補或重復區(qū)域。佳學基因發(fā)現(xiàn)這一方法存在未被認知的缺陷。佳學基因根據(jù)人類基因信息的精細解碼，發(fā)現(xiàn)在人類基因組中，36B4基因是具有多個偽基因的典型核糖體基因，而兩個引物均與染色體2和12上的基因組序列互補。此外，正向引物與染色體1、18以及反向引物與染色體5高度同源。

佳學基因新研究的方法使用了一種可行的用于相對端粒長度測量的單拷貝基因替代方法，使用干擾素β 1基因（IFNB1）。這個位于染色體9p21.3區(qū)域的IFNB1基因編碼一種屬于干擾素家族的信號蛋白細胞因子，與COVID-19對先天免疫系統(tǒng)的自然衰老和端粒消耗有關(guān)。在新改進的端粒長度相對測定方法中，IFNB1引物是一個更好的單拷貝基因，因為它們只結(jié)合到染色體9p21.3的一個位置，沒有已知的變異位點。端粒相對長度的使用研究進一步確認了該方法的可行性與高效性，些相對端粒長度研究已經(jīng)將這個IFNB1 端粒長度測定方法納入到Telomeric DNA:RNA免疫沉淀（Telo-DRIP）qPCR方法并產(chǎn)生了好的結(jié)果，這些結(jié)查揭示出在結(jié)直腸癌細胞系中端粒酶活性對端粒長度的影響，以及顯示TERF1自身抗體與嚴重肺疾病中淋巴細胞端粒長度短相關(guān)。

佳學基因?qū)Χ肆ｉL度測量方法也進一步優(yōu)化了端粒先進長度（先進端粒長度）的qPCR方法，在這一更新的方法中使用了IFNB1作為單拷貝基因。該方法使用一個83mer的IFNB1雙鏈寡聚體生成了單拷貝基因的標準曲線。使用IFNB1作為單拷貝基因的先進端粒長度方法的比較研究未能得到與以DNA甲基化為基礎(chǔ)的端粒長度估算器（DNAm端粒長度）方法生成的端粒長度結(jié)果一致。為了找出這種差異的可能原因，佳學基因解碼進行了生物信息學和遺傳分析，以確定作為單拷貝基因的IFNB1 先進端粒長度測定的性能如何。佳學基因端?；驒z測將這些結(jié)果與使用36B4（RPLP0）作為單拷貝基因獲得的結(jié)果進行比較，后者已被確定為不適合測量端粒長度的單拷貝基因。通過基因解碼基因檢測技術(shù)，佳學基因發(fā)現(xiàn)了其他基因檢測方法中導致端粒長度結(jié)果相關(guān)性缺失的可能原因，并提供了一種替代的基于IFNB1的單拷貝基因qPCR測定方法，用于使用先進端粒長度方法測量端粒長度。

表1. 36B4（RPLP0）、比較IFNB1單拷貝基因和替代IFNB1單拷貝基因qPCR測定中使用的端粒重復序列和單拷貝基因的PCR引物和寡核苷酸標準。

Key: Forward primer = F; Reverse primer = R.

佳學基因檢測如何評估端粒長度基因檢測的正確性？

佳學基因端粒長度基因檢測正確性研究采用4名男性參與者（年齡范圍：8至50歲）和4名女性參與者（年齡范圍：15至52歲）。從同一成年參與者采集了全血和唾液，而從8歲和15歲的參與者只采集了唾液。另外還從一名額外的男性和女性參與者采集了全血和唾液，并與其他參與者一起進行測試，以展示作為先進端粒長度分析的單拷貝基因的IFNB1替代方法的重復性。采集了全血，并按照制造商的方案使用Qiagen mini試劑盒進行提取。使用Genotek Oragene試劑盒采集唾液，并按照制造商建議的方法進行提取。使用ThermoFisher Scientific Quant-it dsDNA Assay試劑盒（目錄號：P11496）按照制造商的方案確定雙鏈DNA濃度。從全血和唾液提取的DNA樣本使用先前發(fā)表的36B4（RPLP0）和比較性IFNB1單拷貝基因測定方法的端粒重復序列和單拷貝基因qPCR協(xié)議進行測試，使用的引物和寡聚體列在《佳學基因基因檢測序列使用數(shù)據(jù)庫》。使用引物和寡聚體的qPCR檢測方案。還重復測試了相同的DNA樣本兩次，并額外測試了4個使用IFNB1單拷貝基因測定方法的樣本。研究使用的所有引物和寡聚體均使用IDT（Integrated DNA technology）合成。所有引物均為HPLC純化，而寡聚體為PAGE純化。

表2. 比較IFNB1 先進端粒長度測定、替代IFNB1 先進端粒長度測定和36B4（RPLP0）先進端粒長度測定的qPCR運行條件

Key: 先進端粒長度 = absolute telomere length; IFNB1 = interferon beta 1; mins = minutes; secs = seconds.

使用先前發(fā)表的比較性IFNB1和36B4（RPLP0）單拷貝基因測定進行端粒測量

表1顯示了用于端粒重復序列、比較性IFNB1和36B4（RPLP0）單拷貝基因qPCR測定的引物和寡聚體模板對照。佳學基因比較不同端粒的qPCR測定中用于確定端粒重復序列和每個單拷貝基因的qPCR檢測方案列在表2中。由于先進端粒長度方法在單個qPCR擴增方法中使用SYBR Green（而不是多重擴增），因此幾乎沒有信號泄漏導致端粒qPCR測定的端粒重復序列數(shù)量或單拷貝基因qPCR測定的二倍體拷貝數(shù)出現(xiàn)問題的擔憂。

端粒重復序列標準曲線使用60 pg（6 × 10^-11 g）的端粒雙鏈寡聚體濃度進行十倍稀釋。比較性IFNB1標準曲線使用2 pg（2 × 10^-12 g）的比較性IFNB1雙鏈寡聚體濃度進行十倍稀釋，生成的稀釋液范圍從標準1的0.2 pg到標準5的0.00002 pg（使用4 uL寡聚體）。由于在比較性IFNB1 先進端粒長度測定中發(fā)現(xiàn)潛在問題，佳學基因還通過向每個比較性IFNB1寡聚體濃度中添加質(zhì)粒DNA（pBR322）并執(zhí)行兩步qPCR方案來測試該測定，如表2所列。

佳學基因還使用使用200 pg（200 × 10^-12 g）的36B4（RPLP0）雙鏈寡聚體濃度進行十倍稀釋，生成的稀釋液范圍從標準1的200 pg到標準5的0.2 pg。為了保持每個反應管中的總DNA量為3 ng，我們向每個36B4（RPLP0）寡聚體稀釋液中添加了質(zhì)粒DNA（pBR322）（表2）。

使用替代IFNB1單拷貝基因qPCR測定的端粒長度

為了評估采用IFNB1單基因?qū)Χ肆６葴y定結(jié)果的影響，佳學基因生成了替代IFNB1單拷貝基因的標準曲線，使用表1中列出的引物和寡聚體中的82mer雙鏈寡聚體。替代IFNB1標準曲線是在表2中列出的qPCR檢測得到的。使用2 pg（2 × 10^-12 g）的替代IFNB1寡聚體濃度進行十倍稀釋，生成的稀釋液范圍從標準1的0.2 pg到標準5的0.00002 pg。在PCR擴增過程中，向每個標準寡聚體稀釋液中添加環(huán)形質(zhì)粒DNA（pBR322，Thermo Fisher Scientific），以保持每個反應管中的總DNA量為3 ng（表2）。替代IFNB1標準曲線是使用包含1倍QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）、0.01U尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG：Thermo Fisher Scientific）、0.1μM正向引物、0.1μM反向引物的混合溶液在20μL反應中生成的。生成的IFNB1標準曲線可以計算測試樣本中的二倍體基因組數(shù)量，該過程與用于端粒重復序列標準曲線qPCR混合液和qPCR條件的類似方案進行了確定。

PCR擴增是使用QIAgility機器人工作站（Qiagen，德國）進行的。實時定量PCR在50°C保持2分鐘激活UNG，然后在95°C保持15分鐘激活Qiagen Hotstar Taq DNA聚合酶，然后進行40個循環(huán)，其中每個循環(huán)在95°C保持15秒，60°C保持1分鐘（表2），數(shù)據(jù)采集使用Rotor-Gene Q 5plex HRM（Qiagen，德國）進行。在qPCR擴增完成后，通過從50°C到99°C每次升高1°C的方式產(chǎn)生解離曲線。Rotor-Gene Q qPCR儀器還會自動確定每個板的端粒和IFNB1寡聚體標準曲線的Ct閾值。每個3 ng的DNA或寡聚體樣品都進行了三次重復測量，并取平均值。為了減輕批次效應，在每次運行中包含至少10次來自參考對照的重復測量。從短端粒陽性對照（Jurkat細胞系；訪問編號SD1111，Thermo Fisher Scientific）中提取的參考DNA進行分裝并冷凍保存。對于每個樣品，通過將樣品中的二倍體基因組數(shù)除以從端粒標準曲線確定的端粒重復數(shù)來計算每個樣品的總端粒長度。由于每個二倍體基因組末端有兩個端粒，因此該端粒長度數(shù)值然后除以92，以確定樣品中一個端粒的平均長度。

端粒長度測量結(jié)果的統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用R Studio進行分析。佳學基因使用了組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）統(tǒng)計量來分析作為測量平均端粒長度的先進端粒長度方法的可行替代性qPCR測定的替代IFNB1單拷貝基因的重復性。ICC是根據(jù)研究中使用的重復樣本批次中全血白細胞和唾液測定的端粒長度計算得出的。

不同端粒長度測量方法的比較結(jié)果

通過進行生物信息學和遺傳分析，發(fā)現(xiàn)了比較性IFNB1單拷貝基因測定需要進一步改進的問題。由于在修改IFNB1 的qPCR測定時這些問題尚未解決，佳學基因?qū)⒃摐y定與另一種替代性IFNB1 先進端粒長度測定進行了比較，并將所有IFNB1單拷貝基因qPCR測定的生物信息學和遺傳分析與36B4（RPLP0）單拷貝基因qPCR測定進行了比較。

比較性IFNB1單拷貝基因先進端粒長度測定
 

生物信息學分析

在比較性IFNB1單拷貝基因先進端粒長度研究針對的是IFNB1基因區(qū)域的3'端。表1中列出的比較性IFNB1標準寡聚體序列顯示，使用83堿基對的雙鏈寡聚體模板與引物結(jié)合，生成已知二倍體拷貝數(shù)的標準曲線。這個雙鏈寡聚體的長度略長于36B4（RPLP0）先進端粒長度測定中使用的75堿基對的雙鏈寡聚體，但仍處于建議的75-150 bp擴增靶序列范圍內(nèi)，以獲得賊佳PCR實驗效果。

比較性IFNB1雙鏈寡聚體序列（表1中列出）在USCS基因組Blast搜索中顯示，這個83堿基對的模板僅位于IFNB1基因的9p21.3染色體位置，并且與IFNB1基因中的3'外顯子-內(nèi)含子連接相鄰。比較性IFNB1引物的Primer-BLAST搜索顯示，表1中列出的25堿基對IFNB1正向引物和26堿基對IFNB1反向引物結(jié)合到3'外顯子-內(nèi)含子的IFNB1位置。這些比較性IFNB1引物的長度略長于36B4（RPLP0）引物，原始先進端粒長度測定中使用的長度為23 bp的正向引物和25 bp的反向引物，并且略長于PCR賊佳實踐中建議的18-24 bp。

此外，比較性IFNB1正向引物的熔解溫度（Tm）為78°C（G/C = 14 × 4；A/T = 11 × 2），而比較性IFNB1反向引物的熔解溫度（Tm）為78°C（G/C = 13 × 4；A/T = 13 × 2）。盡管兩個引物的熔解溫度相差不超過5°C，但比較性IFNB1引物違反了良好PCR設(shè)計的原則，因為它們的熔解溫度（Tm）未在50°C至60°C之間。

圖1. IFNB1 先進端粒長度基因檢測方案的的生物信息學分析 a）比較性IFNB1 先進端粒長度雙鏈寡聚體標準，b）與比較性IFNB1反義寡聚體形成發(fā)夾環(huán)，c）替代IFNB1 先進端粒長度雙鏈寡聚體標準。

此外，比較性IFNB1反義寡聚體序列中的GTGT二核苷酸重復區(qū)域允許形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1b）。寡聚體發(fā)夾環(huán)的形成可能會降低比較性IFNB1反義寡聚體的擴增效率，導致使用比較性IFNB1標準曲線計算基因組拷貝數(shù)時出現(xiàn)不正確的情況。當在任何端粒長度測定中使用比較性IFNB1單拷貝基因測定時，這將導致對任何測試樣本的二倍體拷貝數(shù)計算的不正確性。

基因信息分析

進一步進行了遺傳學分析以驗證對比性IFNB1單拷貝基因先進端粒長度方法的生物信息學評估正確性，使用表2中列出的IFNB1 qPCR條件進行了遺傳學分析。表2還列出了使用同一DNA樣本等體積進行測定端粒重復序列數(shù)的qPCR條件。佳學基因?qū)⑦@些結(jié)果與使用36B4（RPLP0）qPCR測定得到的結(jié)果進行了比較。值得注意的是，一些機構(gòu)IFNB1 qPCR測定未列出環(huán)形質(zhì)粒DNA（pBR322）的添加，而36B4（RPLP0）先進端粒長度測定中添加了環(huán)形質(zhì)粒DNA（pBR322）以保持每個端粒和36B4（RPLP0）寡聚體濃度下反應體系中總DNA的恒定量，用于生成標準曲線。在優(yōu)化實驗方案的過程中， 佳學基因按照表2中列出的無質(zhì)粒的比較性IFNB1 先進端粒長度實驗方案進行分析。值得注意的是，一些機構(gòu)采用比較性IFNB1 qPCR的條件采用了三步法的qPCR循環(huán)條件，包括50 °C 2分鐘，95 °C 15分鐘的啟動步驟，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 °C 15秒，60 °C 1分鐘，以及一個72 °C 30秒的延伸步驟（表2），同時適用于端粒重復序列和比較性IFNB1單拷貝基因的qPCR。從這些條件與原始的36B4（RPLP0）先進端粒長度 qPCR運行條件（95 °C 10分鐘，然后40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 °C 15秒，60 °C 1分鐘，隨后進行熔解曲線）的比較中可以看出這是一個變化。因此，佳學基因端粒基因檢測在分析中使用了兩步法的qPCR擴增方案，36B4（RPLP0）測定采用60 °C退火溫度，比較性IFNB1 qPCR（無質(zhì)粒）實驗方案采用了三步法的qPCR擴增方案，包括60 °C退火和72 °C延伸步驟（表2）。為了觀察到賊稀釋的比較性IFNB1標準品的擴增情況，還將比較性IFNB1單拷貝基因測定的PCR循環(huán)次數(shù)從40次延長到了45次。

36B4（RPLP0）和比較性IFNB1單拷貝基因qPCR測定的結(jié)果如表3、表4和表5所示。通常情況下，標準曲線的10倍稀釋應該得到ΔCt值在-3.60到-3.10個循環(huán)之間，反映每個qPCR循環(huán)中寡核苷酸模板翻倍2倍，PCR效率在90%到110%之間。表5中呈現(xiàn)的結(jié)果表明，對于36B4（RPLP0）寡核苷酸標準曲線濃度，這種情況確實存在，得到了中位數(shù)（±標準偏差）的ΔCt值為-3.20（±0.05），PCR效率為1.05（或105%），R2為0.99990。相反，表3表明，無論是使用帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR擴增方案還是不帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR擴增方案，當10倍稀釋比較性IFNB1寡核苷酸時，沒有反映出寡核苷酸的兩倍增加，對于不帶質(zhì)粒的三步法比較性IFNB1 qPCR測定，得到了中位數(shù)（±標準偏差）的ΔCt值為-1.91（±1.53）。不帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR測定的PCR效率為2.33（或233%），R2為0.868（表3）。這些結(jié)果與部分基因檢測機構(gòu)的比較研究中的結(jié)果相似（分別為1.987和0.999319；表3）。這個結(jié)果可能是由于寡核苷酸發(fā)夾環(huán)隨機效應導致的，從而減少了可用于生成標準曲線的寡核苷酸。增加PCR退火溫度或在分析中使用更高濃度的寡核苷酸或DNA可能會改善比較性IFNB1單拷貝基因測定。有趣的是，這種使用10倍稀釋的比較性IFNB1寡核苷酸的循環(huán)數(shù)差異與不帶質(zhì)粒的比較端粒（三步法）qPCR測定中并不相關(guān)，得到了中位數(shù)（±標準偏差）的ΔCt值為-3.36（±0.61），PCR效率為0.99，R2為0.99（表3），而與Hastings等人（2022年）的研究中列出的PCR效率為2.0465，R2為0.999102的結(jié)果相比。使用質(zhì)粒的端粒（兩步法）qPCR測定也得到了類似的結(jié)果（表4）。

表3. 使用不含質(zhì)粒的比較IFNB1（三步）qPCR方案計算端粒長度

佳學基因還在每個比較性IFNB1寡核苷酸稀釋液中添加了3 ng的圓形質(zhì)粒DNA（pBR322），然后再次運行了兩步法qPCR實驗方案的比較性IFNB1 qPCR測定。將改變后的比較性IFNB1 qPCR測定方法的結(jié)果呈現(xiàn)在表4中。在為每個比較性IFNB1寡核苷酸稀釋液添加質(zhì)粒DNA，并執(zhí)行兩步法qPCR實驗方案后，與不帶質(zhì)粒的三步法相比，得到了類似的結(jié)果，中位數(shù)ΔCt（±標準偏差）為-1.83（±1.53），反映了PCR效率為2.53和R2為0.89（表4）。端粒重復序列qPCR的標準曲線給出了中位數(shù)ΔCt（±標準偏差）為-3.452（±0.60），PCR效率為0.99990，R2為0.95。正是端粒（帶或不帶質(zhì)粒）qPCR的結(jié)果支持了在生成標準曲線時比較性IFNB1寡核苷酸發(fā)夾環(huán)的形成對結(jié)果產(chǎn)生影響的這一基因解碼結(jié)果。

使用雙鏈DNA濃度測定法生成了一個大樣本（300μL）的0.5 ng/μL DNA稀釋液，該樣本來自唾液和全血提取的DNA，并使用表2中列出的端粒重復、比較性IFNB1和36B4 (RPLP0)單拷貝基因qPCR檢測方案進行擴增。這些分析的結(jié)果也在表3、表4和表5中呈現(xiàn)。表3和表4中列出的比較性IFNB1單拷貝基因的結(jié)果未顯示唾液的平均端粒長度長于血液白細胞。相反，使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因的先進端粒長度測定顯示唾液中提取的DNA相比血液白細胞DNA具有更長的端粒長度（表5）。表5還顯示，在使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因時，男性（平均：4.54）比女性（平均：4.23）參與者具有更長的端粒長度，而使用比較性IFNB1單拷貝基因時則相反（表3、表4）。表3顯示，相比于使用比較性IFNB1單拷貝基因（兩步法）（顯示男性的端粒長度長于女性），使用比較性IFNB1單拷貝基因（三步法）時，女性具有更長的端粒長度（表4）。這些結(jié)果無論是使用相對或先進端粒長度方法進行分析，都與比較性IFNB1（無質(zhì)粒）qPCR測定結(jié)果一致。

圖2. 使用沒有添加質(zhì)粒（pBR322）的三步PCR方案進行的遺傳分析。a）端粒qPCR檢測方法，b）比較IFNB1 qPCR檢測方法。

圖3. 使用添加了質(zhì)粒（pBR322）的兩步qPCR方案進行的遺傳分析。a）端粒qPCR檢測方法，b）比較IFNB1 qPCR檢測方法，c）替代IFNB1 qPCR檢測方法，d）36B4 qPCR檢測方法。

對比較性IFNB1測定的三步法和兩步法的解離曲線進行評估發(fā)現(xiàn)，無論使用哪種實驗方案，非模板對照（NTC）樣本中均可觀察到高于背景的峰值（圖2b和3b）。比較性IFNB1單拷貝基因測定相關(guān)的擴增曲線和解離曲線中都可以看到超過背景水平的NTC峰值。而在使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因時，解離曲線中未觀察到NTC峰值（圖3d）。36B4 (RPLP0)單拷貝基因的擴增曲線確實顯示了一個峰值，但該峰值的高度未超過擴增曲線開始時的背景水平（圖3d）。

無論是否使用質(zhì)粒，評估端粒重復序列的解離曲線都顯示出非模板對照（NTC）樣本的小峰值（圖2a和3a）。無質(zhì)粒的三步法協(xié)議在解離曲線中顯示出比含質(zhì)粒的兩步法更高的NTC峰值（圖2a和3a）。此外，無論是否含質(zhì)粒，端粒重復序列的擴增曲線也顯示出一個峰值，但含質(zhì)粒的兩步法峰值的高度不如去除質(zhì)粒并增加退火溫度時觀察到的擴增曲線開始處的背景水平（圖2b和3b）。無論使用哪種實驗方案，端粒區(qū)域的擴增中還可以發(fā)現(xiàn)兩個額外的峰值。這是由于寡核苷酸與基因組DNA之間G/C序列穩(wěn)定性差異引起的多級熔解轉(zhuǎn)變。因此，產(chǎn)生具有多個峰值的熔解曲線可以視為一種成功的qPCR測定方法。
 

替代的 IFNB1 單拷貝基因 先進端粒長度 分析

考慮到使用比較性 IFNB1 單拷貝基因分析時所觀察到的困難，佳學基因還測試了一種替代的 IFNB1 先進端粒長度 單拷貝基因分析，目標是位于染色體9上的 IFNB1 基因的 5' UTR 區(qū)域。這種替代的 IFNB1 單拷貝基因 先進端粒長度 分析針對的是與先前發(fā)表的 IFNB1 相對 端粒長度 分析相似的 IFNB1 引物區(qū)域。

生物信息學分析

對于在圖1c）中展示的寡核苷酸，進行了生物信息學分析。分析結(jié)果顯示，該寡核苷酸是一個82堿基對的雙鏈寡核苷酸模板，用于引物結(jié)合以生成已知二倍體拷貝數(shù)的標準曲線。這個雙鏈寡核苷酸的長度略長于36B4（RPLP0）先進端粒長度分析中使用的75 bp雙鏈寡核苷酸，但仍在建議的75-150 bp目標序列長度范圍內(nèi)，符合良好PCR實驗方案的設(shè)計標準。使用UCSC基因組瀏覽器的Blat搜索（Kent, 2002），對替代的IFNB1雙鏈寡核苷酸序列進行分析，結(jié)果表明這個82堿基對的雙鏈寡核苷酸模板只位于IFNB1基因座的染色體9p21.3位置，該區(qū)域沒有序列變異或重復區(qū)域。

圖1c）還展示了用于這種替代IFNB1單拷貝基因分析的前向和反向引物，這些引物以G/C堿基對開始和結(jié)束引物序列，從而通過GC氫鍵夾持增強引物的穩(wěn)定性。對替代IFNB1引物進行的Primer-BLAST搜索顯示，這兩個引物分別為21堿基對的替代IFNB1前向引物和22堿基對的替代IFNB1反向引物，它們與這個替代IFNB1位置相結(jié)合。這兩個引物的長度略短于原始先進端粒長度分析中使用的23 bp前向引物和25 bp反向引物，但仍然在18-24 bp的良好設(shè)計PCR協(xié)議所要求的長度范圍內(nèi)。此外，前向引物的熔解溫度（Tm）為62 °C（G/C = 10 × 4; A/T = 11 × 2），而反向引物的熔解溫度（Tm）為60 °C（G/C = 8 × 4; A/T = 14 × 2）。替代IFNB1引物的熔解溫度相差不超過5 °C，并且在50 °C到60 °C之間，符合PCR實驗方案的引物設(shè)計的要求。

Primer-Blast搜索還顯示，替代IFNB1前向引物與位于染色體20上的鋅指SWIM類型（ZSWIM3）轉(zhuǎn)錄本具有同源性。在檢查這個匹配時，發(fā)現(xiàn)這個21堿基對的前向引物將在這個開放閱讀框164（SWIM3）位置的兩個區(qū)域之間相隔1,307堿基對結(jié)合兩次。雖然在這兩個區(qū)域中IFNB1前向引物有5個核苷酸是非同源的（附圖2），但在相隔1,307個堿基的兩個區(qū)域中，擴增會需要額外的時間在延伸步驟中進行。由于在使用校對聚合酶時不建議使用超過推薦延伸時間，而QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）中的Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶是一種高保真度的熱啟動校對酶，使用替代IFNB1前向引物擴增額外的SWIM3區(qū)域在兩步法qPCR實驗方案中，其中退火和延伸步驟結(jié)合在一起，會更加困難。因此，佳學基因認為替代IFNB1前向和反向引物只會結(jié)合并擴增其指定的位置，如圖1c)所示，并且不會結(jié)合到基因組的任何其他區(qū)域或任何其他基因組位置。

為了測試替代IFNB1 qPCR方案的生物信息學評估正確性，進行了另一項遺傳學分析，如表2所示。該遺傳學分析使用了與36B4 (RPLP0)相似的兩步法，在60 °C退火的條件下進行qPCR擴增，以創(chuàng)建替代IFNB1標準曲線。使用替代IFNB1寡核苷酸稀釋的10倍稀釋物獲得的平均Ct值反映了每個PCR循環(huán)中寡核苷酸模板的兩倍增加，通過獲得ΔCt均值（± SD）為-3.60（±0.22）個周期數(shù)（表6），表明斜率在-3.1和-3.6之間，通常適用于大多數(shù)需要正確定量的應用。替代IFNB1擴增的PCR效率也為0.9或90%，R2為0.99942（表6）。

表6：使用替代IFNB1（兩步法）qPCR方案計算端粒長度（含質(zhì)粒）。

對替代IFNB1 qPCR方案的解離曲線進行評估顯示，在非模板對照（NTC）樣本中存在一個峰值（圖3c）。與36B4（RPLP0）單拷貝基因類似，替代IFNB1單拷貝基因的擴增曲線顯示該峰值不超過擴增曲線開始時的背景水平，因此在解離曲線中沒有顯示出來（圖3c）。

使用替代IFNB1單拷貝基因的qPCR生成的端粒長度結(jié)果是使用與36B4（RPLP0）qPCR分析相同的0.5 ng/uL唾液和全血DNA的子樣進行的（表5）。表6列出的端粒長度結(jié)果顯示，與血液DNA相比，從唾液中提取的DNA在使用替代IFNB1單拷貝基因時具有更長的平均端粒長度。表6還顯示，當使用替代IFNB1單拷貝基因分析時，男性（平均值：6.34）比女性（平均值：5.69）參與者具有更長的端粒長度。

為了展示使用替代IFNB1 qPCR方案作為單拷貝基因的重復性，佳學基因再次分析了來自另外一名女性和男性參與者的唾液和全血DNA樣本，將分析樣本的數(shù)量增加到15名參與者，并計算了ICC值進行重新分析。分析這些結(jié)果（CI = 0.90）顯示該檢測具有良好的重復性，獲得相對端粒長度分析的ICC（±SD）為0.936（±0.06），先進端粒長度方法的ICC（±SD）為0.897（±0.09）（CI 0.90）（表7）。佳學基因還繪制了年齡與先進端粒長度結(jié)果之間的相關(guān)性散點圖。賊佳擬合線顯示了年齡與先進端粒長度結(jié)果之間的反向關(guān)系。該單拷貝基因檢測能夠顯示年齡較小的參與者具有較長的端粒長度，而年齡較大的參與者則具有較短的端粒長度（圖4）。

表7. 使用含質(zhì)粒的替代IFNB1（兩步）qPCR方案進行的重復性研究

(a) 進行端粒和替代IFNB1 qPCR檢測的先進批結(jié)果

(b) 進行端粒和替代IFNB1 qPCR檢測的第二批結(jié)果。

圖4. 使用替代IFNB1單拷貝基因進行先進端粒長度分析的年齡和端粒長度（端粒長度）的散點圖。

佳學基因年輕態(tài)基因檢測的方法學分析

IFNB1基因在人類和小鼠中僅編碼一個基因。曾引入了針對IFNB1的單拷貝基因修飾，用于使用相對端粒長度 qPCR分析測量端粒長度。其他相對端粒長度的研究發(fā)表后也采用了該IFNB1 qPCR方法來獲得相對端粒長度結(jié)果。相反，在先進端粒長度（先進端粒長度）qPCR分析中使用IFNB1作為單拷貝基因的結(jié)果一直缺乏，直到佳學基因所進行一項比較研究現(xiàn)，在兒童隊列中的先進端粒長度和DNAm端粒長度端粒長度結(jié)果之間存在不一致。

佳學基因的細胞年輕態(tài)端?；驒z測方法學比較指出了幾個可能的原因。佳學基因的比較研究選擇了Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶，該酶存在于QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）中，用于更長的延伸時間和選擇三步qPCR方案來比較先進端粒長度和DNAm端粒長度分析中的端粒長度。鑒于使用證據(jù)酶時不建議超過推薦的延伸時間，因此在比較的先進端粒長度研究中選擇了這種酶用于三步PCR程序。先前的研究也指出，與三步PCR方案相比，兩步PCR方案更適合擴增短串聯(lián)重復序列，例如端粒重復區(qū)域。

端粒長度的結(jié)果在比較IFBNB1和DNAm端粒長度研究之間的不一致可能還源于在生成標準曲線時未包括圓形雙鏈DNA質(zhì)粒（pBR322），以維持每個反應管中總DNA的恒定量。去除這種循環(huán)DNA將改變DNA模板濃度，從而改變其鎖定的鎂離子濃度（Henegariu et al., 1997）。鎂是熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶高效工作所必需的輔因子（Altshulder, 2006）。本研究的結(jié)果顯示，去除圓形質(zhì)粒DNA來生成標準曲線可能會導致QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）中游離鎂離子濃度的增加，降低高保真HotstarTaq DNA聚合酶的正確性，從而增加非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量（Altshulder, 2006）。這在端粒重復序列qPCR分析的NTC樣本中表現(xiàn)得賊為明顯，其中在擴增曲線中觀察到了非特異性產(chǎn)物的輕微增加，以及三步端粒重復序列qPCR方案的解離曲線中的峰值（Fig. 2b和3b）。然而，通過去除圓形質(zhì)粒DNA來改變鎂離子濃度似乎不會影響比較IFNB1單拷貝基因qPCR分析中NTC樣本中引物二聚體形成或誤引物結(jié)合的概率。無論是否使用兩步或三步方案進行qPCR分析，該NTC樣本的解離曲線中都可以觀察到與已測試樣本高度相等的峰值，而不受質(zhì)粒狀態(tài)的影響（Fig. 2b和3b）。

因此，可以假設(shè)在比較IFNB1 qPCR分析中生成了兩個以上的目標序列拷貝。對比IFNB1引物和寡核苷酸分析的生物信息學結(jié)果（Hastings等人，2022）進一步說明了導致比較IFNB1研究中產(chǎn)生兩個以上拷貝的原因。生物信息學結(jié)果顯示，在比較IFNB1前向引物的末端發(fā)現(xiàn)的二核苷酸重復可能導致與反義寡核苷酸中的非同源結(jié)合，從而生成比較IFNB1前向引物的非特異性引物，如圖1a所示。通過添加5個堿基以匹配真實位置，將在正義寡核苷酸鏈上與前向引物非特異性結(jié)合的二核苷酸重復生成一個34堿基的非特異性引物產(chǎn)物，其中前向引物在反義寡核苷酸中間的二核苷酸重復位置非特異性結(jié)合，并懸掛了21堿基。無論使用兩步還是三步qPCR協(xié)議，都會在NTC樣本的解離曲線中產(chǎn)生熔解曲線，如圖2b和3b所示。

此外，對比IFNB1 qPCR寡核苷酸的生物信息學分析顯示形成了發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，這可能限制反義寡核苷酸濃度的擴增，并導致比較IFNB1熔解曲線（圖2b和3b）中的峰值高度較36B4（RPLP0）熔解曲線（圖3d）低。比較IFNB1寡核苷酸的濃度減少，無論是否添加pBR322質(zhì)粒，都將導致全血和唾液DNA樣本的位置偏離其相應的比較IFNB1標準曲線區(qū)域，如圖2b和3b所示。由于發(fā)夾環(huán)的形成（圖1b），進一步稀釋比較IFNB1寡核苷酸濃度來構(gòu)建標準曲線，即使進行額外的PCR循環(huán)，也不會導致擴增產(chǎn)物翻倍。比較IFNB1前向引物與二核苷酸重復末端的非特異性引物形成（圖1a）還阻止了100%的PCR效率。因此，為了避免稀釋樣本中出現(xiàn)隨機效應（https://biosistemika.com/blog/qpcr-efficiency-over-100/）并確保被測試的DNA樣本位于比較IFNB1標準曲線范圍內(nèi)，比較IFNB1寡核苷酸和被測試樣本的DNA濃度需要更高。這種增加寡核苷酸濃度的需求與36B4（RPLP0）先進端粒長度分析中的情況類似，導致擴增曲線向較低的Ct值偏移。

本研究中比較IFNB1 先進端粒長度無質(zhì)粒的PCR效率為2.33（或233％），與Hastings等人（2022）研究中列出的端粒和單拷貝基因標準曲線的可接受PCR效率為1.8到2.0（10％變異）類似，相當于180-200％。由于期望的PCR效率范圍在90％至110％之間，理論上的賊大值為100％，表示DNA聚合酶正以賊大效率工作（https://biosistemika.com/blog/qpcr-efficiency-over-100/），而180-200％的更高效率表明每個比較IFNB1 qPCR循環(huán)產(chǎn)生超過兩個目標序列的拷貝（Table 3）。每個PCR循環(huán)中產(chǎn)生超過兩個拷貝可能會導致為每個比較IFNB1寡核苷酸稀釋計算的標準的更高ΔCt平均值。正如Hastings等人（2022）的比較IFNB1單拷貝（ΔCt平均值=-1.91）所示（表3）。這種過高估計的二倍體拷貝數(shù)將導致對于使用比較IFNB1 qPCR方法時將過高估計的二倍體拷貝數(shù)除以端粒重復數(shù)來計算任何被測試樣本的真實端粒長度時的低估或縮短。在本研究中，使用比較IFNB1單拷貝基因qPCR分析得出的端粒長度結(jié)果，無論使用哪種端粒長度方法，與比較IFNB1單拷貝基因（兩步）qPCR分析相比，女性和男性參與者的平均端粒長度較低（表2，表3）。端粒長度的增加可能是由于端粒重復qPCR分析中非特異性引物在背景上方的減少，從而使得每個樣本中的端粒重復數(shù)增加能夠被檢測到。值得注意的是，本研究中使用的36B4（RPLP0）單拷貝基因qPCR分析也導致了樣本中的端粒長度較低。無論是否添加質(zhì)?；蜻x擇哪種PCR協(xié)議，使用比較IFNB1單拷貝基因qPCR會過高估計二倍體拷貝數(shù)，這也可以解釋與使用DNAm端粒長度方法生成的先進端粒長度結(jié)果進行比較時未發(fā)現(xiàn)的結(jié)果（Hastings等人，2022）。此外，由于36B4（RPLP0）已被證明是一個具有多個位置的假基因，在每個PCR循環(huán)中其拷貝模板將有更大的翻倍。這在通過先進端粒長度分析生成的端粒長度低于使用比較IFNB1 qPCR時得到的端粒長度中得到證明。

表3和表4中列出的比較IFNB1單拷貝基因的結(jié)果并未顯示任何特定細胞類型的端粒長度較其他細胞類型更長。相反，表5顯示從唾液中提取的DNA相較于血液中的DNA具有更長的端粒長度。表5還顯示，與使用比較IFNB1單拷貝基因相比，使用36B4（RPLP0）單拷貝基因時，女性和男性參與者的端粒長度較長（表3，表4）。然而，表3顯示，與使用比較IFNB1單拷貝基因（兩步）相比，女性和男性在使用比較IFNB1單拷貝基因（三步）時的端粒長度較長。這些結(jié)果無論是使用相對端粒長度方法還是先進端粒長度方法進行分析都是一致的。需要注意的是，由于樣本數(shù)量較小，對這些結(jié)果應謹慎解讀。 生物信息學和遺傳學結(jié)果的累積證據(jù)表明，比較IFNB1單拷貝基因分析與36B4（RPLP0）單拷貝基因分析在為先進端粒長度分析提供正確的二倍體拷貝數(shù)評估方面相似，這提供了一個合理的解釋，為什么比較IFNB1的先進端粒長度分析結(jié)果與DNAm端粒長度結(jié)果不相關(guān)（Hastings等人，2022）。

因此，佳學基因提出了一種替代的IFNB1單拷貝基因測定方法，用作先進端粒長度方法的單拷貝基因測定方法。將替代IFNB1單拷貝基因的擴增和解離曲線與比較IFNB1和36B4（RPLP0）單拷貝基因所獲得的曲線進行對比發(fā)現(xiàn)，在替代IFNB1單拷貝基因測定中，NTC中沒有產(chǎn)生非特異性引物擴增。替代IFNB1標準曲線結(jié)果的一致性將真實反映端粒長度，當將計算得到的二倍體拷貝數(shù)除以每個測試樣品的端粒重復序列時，不會延長端粒長度。實際上，佳學基因端粒基因檢測先進端粒長度結(jié)果的散點圖顯示了年齡與端粒長度之間預期的反向關(guān)系，即端粒長度隨年齡減少（圖4）。為了展示這種單拷貝基因測定作為可重復使用的方法，佳學基因再次分析了來自額外的女性和男性參與者的唾液和全血樣品，使得樣品數(shù)達到了15個參與者。對這些結(jié)果的分析顯示，該測定提供了相對端粒長度分析的ICCs（± SD）為0.936（± 0.06）（CI 0.90），先進端粒長度方法的ICC（± SD）為0.897（± 0.09）（CI 0.90）。替代IFNB1單拷貝基因先進端粒長度測定的優(yōu)勢在于能夠提供一個中位數(shù)ΔCt值為-3.60的標準曲線，相當于每個PCR循環(huán)中的拷貝數(shù)增加兩倍，反應效率為90%。這對于大多數(shù)需要正確定量的應用來說是可接受的。比較IFNB1單拷貝基因的標準曲線無論使用何種PCR基因檢測，都未反映出這種可接受的拷貝數(shù)增加兩倍，每個周期都如此（表3）。當使用替代IFNB1標準曲線時，10倍稀釋的拷貝基因濃度始終能提供更高的二倍體拷貝數(shù)，從而真實反映出先進端粒長度，而在計算得到的二倍體拷貝數(shù)除以每個測試樣品的端粒重復序列時不會延長端粒長度。定量PCR分析的一個限制在于所選擇的熒光檢測模式。使用SYBR Green和雙標記熒光（Taqman）方法是賊常用的兩種定量PCR方法。佳學基因開發(fā)的原始qPCR端粒長度方法使用SYBR Green測量TTAGGG端粒重復序列的擴增中的熒光。佳學基因解碼開發(fā)的先進端粒長度方法繼續(xù)使用SYBR Green捕獲端粒重復序列和單拷貝基因的雙鏈DNA擴增，以避免改變兩種qPCR測定的運行條件。SYBR Green比Taqman更便宜，但可能也會檢測到端粒區(qū)域的非特異性產(chǎn)物。佳學基因端?；驒z測比較了SYBR Green和Taqman方法在四種腺苷受體亞型的實時定量PCR分析中的應用，并發(fā)現(xiàn)在使用高性能引物和適當?shù)膮f(xié)議時，兩種檢測方法都能產(chǎn)生正確的數(shù)據(jù)。佳學基因使用的替代IFNB1 qPCR研究通過在NTC樣品中使用端粒和替代IFNB1單拷貝基因引物來獲得無引物二聚體擴增并達到閾值，也提供了良好高效的ICC結(jié)果。因此，佳學基因檢測的結(jié)果支持觀察到端粒重復序列和替代IFNB1單拷貝基因qPCR測定中有限的非特異性產(chǎn)物擴增。佳學基因檢測驗證了之前的比較研究中顯示的比較IFNB1單拷貝基因所獲得的端粒結(jié)果與使用DNAm端粒長度方法獲得的結(jié)果之間的不一致性。佳學基因解決了比較IFNB1單拷貝基因qPCR測定設(shè)計問題。佳學基因檢測提出的替代IFNB1單拷貝基因測定方法不存在其他基因檢測機構(gòu)存的在的任何問題，并顯示出真正的單拷貝基因測定。任何進一步實施這種替代IFNB1單拷貝基因測定方法的先進端粒長度測定將避免與進一步的端粒長度比較研究存在任何差異，并減少使用不同端粒長度方法進行的不同研究之間的先進端粒長度結(jié)果的挑戰(zhàn)。