多重?zé)晒舛?PCR 技術(shù)

1.1 基于熒光探針的多重 PCR 技術(shù)

1.2 基于探針編碼的多重 PCR 技術(shù)

1.3 基于熒光染料的多重 PCR 技術(shù)

1.4 基于熒光探針熔解曲線(xiàn)的多重 PCR 技術(shù)

02

膜層析技術(shù) (Membrane chromatography) 是在柱層析技術(shù)上發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，以膜介質(zhì)為基質(zhì)，偶聯(lián)相應(yīng)的離子交換、親和、疏水等化學(xué)基團(tuán)，制作而成的一種新型的層析介質(zhì)。膜層析技術(shù)具有簡(jiǎn)單快速并且能夠自動(dòng)分離液體混合物的優(yōu)點(diǎn)，而多重 PCR 技術(shù)具有有效富集目的片段的優(yōu)點(diǎn)，將這兩種技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一起能夠形成一種靈敏度高、特異性好、成本低、簡(jiǎn)便快速的多重核酸檢測(cè)方法。

該方法提前將靶標(biāo)特異性的捕獲探針固定在層析膜的不同位置上，然后使變性后的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)作用經(jīng)過(guò)層析膜，固定在特定位置的捕獲探針通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的作用將末端帶有膠體金或熒光素的產(chǎn)物捕獲，而非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物及引物被洗脫，賊后通過(guò)肉眼或熒光檢測(cè)儀對(duì)產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)和識(shí)別 (圖 4) [32] 。

Mao 等 [33] 基于膠體金標(biāo)記的核酸探針和側(cè)流試紙條建立了一種現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)目的基因的方法，利用這種核酸層析金標(biāo)試紙條能夠在 15 min內(nèi)檢測(cè)出核酸樣本。Carter 等 [34] 發(fā)明的側(cè)流微陣列方法能夠快速、靈敏地對(duì)多種核酸進(jìn)行檢測(cè)，并且不需要專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備，這種方法以微型側(cè)流設(shè)備為基礎(chǔ)，利用核酸雜交介導(dǎo)靶標(biāo)的捕獲。Gomez-Martinez等 [32] 開(kāi)發(fā)的多重核酸檢測(cè)試紙條在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)了對(duì) 108 例獻(xiàn)血者血型相關(guān)基因型的正確鑒定。

基于膜層析的多重檢測(cè)技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、攜帶便捷等優(yōu)點(diǎn)拓寬了可檢測(cè)的范圍，使檢測(cè)不再局限于實(shí)驗(yàn)室，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)也能夠?qū)?/span>現(xiàn) [35-37] ，但是膜層析技術(shù)中樣品的阻滯、非特異性雜交等問(wèn)題仍然是今后需要解決的問(wèn)題。

液相芯片技術(shù) (Liquid chip technology) 被稱(chēng)為后基因組時(shí)代的芯片技術(shù)，也被稱(chēng)為 xMAP 技術(shù)。它可以同時(shí)對(duì) 1 份標(biāo)本中的 100 種不同目的分子進(jìn)行檢測(cè)，并能在 30 min 內(nèi)檢測(cè) 96 個(gè)不同的樣本。

其液相微球編碼原理為，將兩種熒光染料分別用 10 種不同的濃度兩兩混合形成 10×10的熒光配比陣列，并對(duì)微球進(jìn)行染色，得到 100 種不同熒光編碼的微球。將熒光編碼且共價(jià)結(jié)合了不同捕獲探針的微球懸浮于一個(gè)液相體系中，先加入待檢測(cè)分子與其反應(yīng)，再加入帶有熒光標(biāo)記的報(bào)告分子，從而形成“微球-捕獲探針-靶標(biāo)-報(bào)告分子”復(fù)合物。

檢測(cè)時(shí)，該復(fù)合物在鞘液的作用下將逐個(gè)通過(guò)檢測(cè)通道，接受兩束不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射并對(duì)相應(yīng)的發(fā)射光進(jìn)行檢測(cè)，其中一束激光用于識(shí)別微球種類(lèi)，即判定該種微球是對(duì)哪種特定的靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，另一束激光用于檢測(cè)微球上報(bào)告分子的熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定性和定量分析 (圖 5) [38] 。

Sherry 等 [39] 利用 Luminex液相芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)沙門(mén)氏菌和其他病原菌的檢測(cè)和鑒定。Rajeswari 等 [40] 利用 Luminex 液相芯片技術(shù)和液滴生成技術(shù)成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)禽流感病毒、傳染性猴氣管炎病毒和空腸彎曲菌的檢測(cè)和鑒別。Song 等 [41] 利用 Luminex 液相芯片技術(shù)同時(shí)對(duì) 11 種不同的突變型進(jìn)行檢測(cè)和分型。

雖然基于Luminex 液相芯片技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)對(duì)多種不同病原體的檢測(cè)和鑒別，但它僅在檢測(cè)方面發(fā)揮了其多通量、高效率的特性，其實(shí)質(zhì)上并沒(méi)有解決多重?cái)U(kuò)增中眾多引物、探針、模板間相互錯(cuò)配的問(wèn)題。因此，未來(lái)開(kāi)發(fā)出微球表面多重?cái)U(kuò)增以及Luminex 液相芯片檢測(cè)一體化的技術(shù)是核酸多重檢測(cè)的重要研究方向。

MPCR 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于它的高效性，通過(guò)一次擴(kuò)增反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體進(jìn)行檢測(cè)和鑒別，相較多個(gè)單重檢測(cè)而言成本顯著降低。

MPCR 有著廣泛的應(yīng)用前景，但是仍然存在許多影響 MPCR 擴(kuò)增與檢測(cè)效果的因素 (表 1)，其中擴(kuò)增效率的一致性是賊大的難題，檢測(cè)重?cái)?shù)越多，效率一致性往往越低。針對(duì) MPCR 擴(kuò)增效率一致性的問(wèn)題，傳統(tǒng)單管多靶標(biāo)擴(kuò)增的方式通過(guò)不斷優(yōu)化反應(yīng)體系中緩沖液、酶、引物、探針等的用量，確保每一重的擴(kuò)增效率保持一致，然而隨著檢測(cè)重?cái)?shù)的增加，形成二聚體甚至多聚體的可能性也大幅上升，輕則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)，靶標(biāo)擴(kuò)增效率下降，檢測(cè)靈敏度和特異性降低，重則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增占據(jù)主導(dǎo)，靶標(biāo)擴(kuò)增失敗，造成假陽(yáng)性和/或假陰性，影響檢測(cè)正確性。

而基于微流控的 MPCR 則將每一重的擴(kuò)增分布在各自相對(duì)獨(dú)立的空間內(nèi)進(jìn)行，在一定程度上降低了引物二聚體的生成，高效了擴(kuò)增效率，但是微流控的實(shí)現(xiàn)相對(duì)較為困難，且當(dāng)模板濃度較低時(shí)，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

相比于上述方法，基于固相載體表面擴(kuò)增的 MPCR 則將不同的引物對(duì)分配至不同的固相載體上，使得每個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增集中于以特定固相顆粒為載體的表面，從根本上解決 MPCR 引物間相互干擾的問(wèn)題，此外將固相載體表面擴(kuò)增與 Luminex 液相芯片檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合能夠同時(shí)對(duì)各固相顆粒及顆粒表面的擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)行特異性識(shí)別，并且理論上能夠?qū)崿F(xiàn)100 重的核酸擴(kuò)增與檢測(cè)，極大地提高了檢測(cè)重?cái)?shù)的同時(shí)又能高效各靶標(biāo)的擴(kuò)增互不干擾，但是由于需要將引物束縛至固相載體，這在一定程度上限制了引物與模板的碰撞概率并且導(dǎo)致其擴(kuò)增效率降低，那么如何提高固相載體表面的擴(kuò)增效率值得深入思考。

針對(duì)上述問(wèn)題，可通過(guò)將反應(yīng)體系分隔成微小液滴，或結(jié)合管式對(duì)流 PCR技術(shù)使反應(yīng)體系在擴(kuò)增的過(guò)程中循環(huán)流動(dòng)，將有望提高引物與模板之間碰撞的概率，同時(shí)提高固相載體表面的擴(kuò)增效率，從而開(kāi)發(fā)出擴(kuò)增效率高、一致性好、體系穩(wěn)定、檢測(cè)重?cái)?shù)高的多重PCR 技術(shù)。