實時熒光定量PCR,英文全稱是Real Time Flurocent Qualitative PCR,簡稱RT-QPCR,或者更簡潔地稱之為Q-PCR 或者是RT-PCR 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術(shù),被廣泛應(yīng)用到生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域, 不僅涉及到對DNA的定量, 核酸多態(tài)性分析, 基因突變分析等,同時對染色體病的診斷、基因病的診斷、腫瘤研究以及用藥評估方面都有廣泛應(yīng)用。腫瘤基因檢測哪里做?
實時熒光定量PCR技術(shù)有很多優(yōu)點,例如特異性好、正確性高、靈敏度高、可定量檢測、 誤差小、操作簡單、自動化程度高、交叉污染和污染環(huán)境機會少等。 同時因不需雜交、電泳、凝膠成像,在實驗進行的過程中就可以真實地展現(xiàn)出實驗結(jié)果。此外, 實時熒光定量PCR技術(shù)在動物檢疫和環(huán)境監(jiān)測等方面也得到了廣泛的應(yīng)用, 使人們的健康得到保障, 同時, 也可使人們深入探索微生物群落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動態(tài)變化過程。腫瘤基因檢測哪里做?
熒光定量PCR,(Real-Time PCR),也叫做qPCR,通過在PCR管中、96孔板或者是384孔板的微型小孔中加入能夠指示反映進程的熒光探染料或者探針,對反應(yīng)的過程中通過代表反映產(chǎn)物的熒光信號的強弱來快速直觀地知道待測DNA的量??梢酝ㄟ^信號產(chǎn)生的時間、出現(xiàn)的位置來進行相對定量。如果設(shè)置不同濃度的標準品,還可以進行先進定量。
同PCR設(shè)計時的三溫度反應(yīng)法,qPCR技術(shù)的全部反應(yīng)過程在一個可以進行良好控制的環(huán)境中進行,降低了污染概率,并且可以通過對熒光信號監(jiān)測從而進行定量檢測,因此臨床應(yīng)用賊為廣泛,已成為PCR中的主導(dǎo)技術(shù)。
所使用的熒光物質(zhì)可分為:TaqMan熒光探針、分子信標和熒光染料。
1)TaqMan熒光探針:
擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號由于距離很近被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,消除淬滅基團對熒光基團的熒光吸收效應(yīng),從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成有效同步。
2)SYBR熒光染料:
在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而高效熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加有效同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應(yīng)是否特異。實時熒光定量PCR 包括探針類和染料類兩種,探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加, 染料類如SYBR Green I 則是利用與雙鏈DNA 小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴增產(chǎn)物的增加對病原DNA 的檢測。Taqman探針法是高度特異的定量PCR技術(shù),其核心是利用taq酶的3’-5’外切核酸酶活性,切斷探針,產(chǎn)生熒光信號。由于探針和模板是特異性結(jié)合,所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。
針對遺傳病的基因突變,設(shè)計跨越突變位點的熒光探針,對跨越突變位點的一段基因進行擴增。擴增結(jié)束時,對產(chǎn)物進行緩慢加熱以獲得熔解曲線,根據(jù)熔解曲線判斷是否有基因突變。腫瘤基因檢測哪里做?
對某種基因型疾病實施藥物治療后,用實時熒光定量PCR 對相關(guān)基因是否轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄量的多少均可以快速正確的監(jiān)控,對臨床有重要指導(dǎo)意義。
癌基因的表達增加和突變在許多腫瘤早期和良性階段就會出現(xiàn), 實時熒光定量PCR不但能有效地檢測基因的突變,而且能正確測定表達量,據(jù)此可進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。
3)分子信標
是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補配對,導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近,不會產(chǎn)生熒光。
PCR產(chǎn)物生成后,退火過程中,分子信標中間部分與特定DNA序列配對,熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。
第二代PCR主要缺點:
靈敏度還有欠缺,低拷貝標本檢測不正確。
存在背景值影響,結(jié)果易受干擾。
當(dāng)反應(yīng)體系中有PCR抑制物時,檢測結(jié)果易受干擾。
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