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【佳學(xué)基因檢測(cè)】人類白細(xì)胞抗原基因分型檢測(cè)體系技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

人類白細(xì)胞抗原基因分型檢測(cè)體系技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) ICS 11.020 CCS C 50 WS/T 7852021 Technical standard for human leukocyte antigen (HLA) genotypingWS/T 7852021 前言 引言 1 范圍 2 規(guī)范性引用文件 3 術(shù)語(yǔ)和定義 IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù) Immuno-Polymorphism Database (IPD 人類主要組織相容性復(fù)合物的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù),包含經(jīng)世界衛(wèi)生組織HLA命名委員會(huì)命名的HLA等位基因序 基于直接測(cè)序的基因分型 sequence based typing,SBT 基于序列特異性

人類白細(xì)胞抗原基因分型檢測(cè)體系技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)
ICS 11.020 CCS C 50 WS/T 785—2021

Technical standard for human leukocyte antigen (HLA) genotypingWS/T 785—2021

人類白細(xì)胞抗原基因分型檢測(cè)體系 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

ICS 11.020 CCS C 50  WS/T 785—2021
Technical standard for human leukocyte antigen (HLA) genotypingWS/T 785—2021

2021-08-27發(fā)布2022-01-01實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布前言

本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì)負(fù)責(zé)技術(shù)審查和技術(shù)咨詢,由國(guó)家衛(wèi)生健康委醫(yī)管中心負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)性和格式審查,由國(guó)家衛(wèi)生健康委醫(yī)政醫(yī)管局負(fù)責(zé)業(yè)務(wù)管理、法規(guī)司負(fù)責(zé)統(tǒng)籌管理。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:北京醫(yī)院、北京紅十字血液中心、中華骨髓庫(kù)管理中心、浙江省血液中心、遼寧省血液中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:蔡劍平、張志欣、肖堯、黑愛(ài)蓮、周曉陽(yáng)、王琳、戴大鵬、張立群、朱發(fā)明、李劍平。

引言

人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)又稱移植抗原,與同種異體組織器官移植以及移植物的排斥反應(yīng)相關(guān)。存在于細(xì)胞膜表面的HLA分子可以結(jié)合來(lái)自細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的肽,形成HLA-肽復(fù)合物,抗原遞呈細(xì)胞將該復(fù)合物遞呈給T細(xì)胞引起一系列的免疫反應(yīng)。

隨著對(duì)HLA研究的深入,20世紀(jì)中葉誕生的器官移植和造血干細(xì)胞移植技術(shù)已成為臨床醫(yī)學(xué)治療和拯救患者生命的重要手段,數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的患者通過(guò)器官移植和造血干細(xì)胞移植獲得了新生。近二十年來(lái),隨著對(duì)免疫抑制劑、HLA配型、HLA抗體檢測(cè)和監(jiān)測(cè)等存活率影響因素的認(rèn)識(shí),器官移植和造血干細(xì)胞移植存活率得到了顯著的改善。HLA組織配型是影響器官移植和造血干細(xì)胞移植存活率及受者生存質(zhì)量的重要因素之一。

HLA基因具有高度的多態(tài)性,決定了所表達(dá)的HLA抗原分子的多態(tài)性。隨著聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction,PCR)技術(shù)在臨床應(yīng)用的日益廣泛,從20世紀(jì)80年代末開(kāi)始HLA分型已從過(guò)去主要采用血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)過(guò)渡到以基因分型檢測(cè)技術(shù)為主?;蚍中蜋z測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、正確度高、能檢測(cè)出血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法無(wú)法檢出的基因型別等優(yōu)點(diǎn),還具有不排斥原有血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)所闡述信息的優(yōu)點(diǎn)。HLA基因分型檢測(cè)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、檢測(cè)的技術(shù)流程以及質(zhì)量控制等提出了更高的要求。長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)一直缺乏HLA基因分型檢測(cè)技術(shù)體系的規(guī)范及要求,在一定程度上影響了HLA基因分型整體檢測(cè)水平的提高和臨床器官移植、造血干細(xì)胞移植標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。

本標(biāo)準(zhǔn)擬建立適用于我國(guó)國(guó)情的HLA基因分型檢測(cè)技術(shù)體系的規(guī)范及要求,旨在提高我國(guó)HLA基因分型實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)水平,更有效地服務(wù)于與HLA相關(guān)的臨床診療工作。

人類白細(xì)胞抗原基因分型檢測(cè)體系技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了HLA基因分型檢測(cè)體系的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于所有開(kāi)展人體標(biāo)本HLA基因分型檢測(cè),提供與臨床疾病的診療、預(yù)防、用藥監(jiān)測(cè)或者移植以及人體健康評(píng)估相關(guān)報(bào)告的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室,也適用于開(kāi)展捐獻(xiàn)者HLA基因分型數(shù)據(jù)入庫(kù)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和對(duì)HLA檢測(cè)進(jìn)行質(zhì)量控制的實(shí)驗(yàn)室。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù) Immuno-Polymorphism Database (IPD)- international ImMunoGeneTics project (IMGT)/HLA database

人類主要組織相容性復(fù)合物的 DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù),包含經(jīng)世界衛(wèi)生組織 HLA命名委員會(huì)命名的 HLA等位基因序列。

    1. 3.2基于直接測(cè)序的基因分型 sequence based typing,SBT

       

    2. 基于核酸直接測(cè)序技術(shù)的基因分型方法。
    1. 3.3基于序列特異性引物的基因分型 sequence-specific primer,SSP

       

    2. 采用等位基因特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增的基因分型方法。
    1. 3.4基于序列特異性寡核苷酸雜交的基因分型 sequence-specific oligonucleotide,SSO

       

    2. 采用特異性序列的寡核苷酸進(jìn)行核酸雜交的基因分型方法。
    1. 3.5基因型 genotype

       

    2. 某一基因或一組基因的具體等位基因組合。
    1. 3.6基因座 locus

       

    2. 基因在染色體上的位置,同一座位上可能有不同類型的等位基因;或一段DNA序列在染色體上的位置。
  1. 3.7擦拭檢測(cè) wipe test

     

是一種通過(guò)擦拭物體表面來(lái)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和臺(tái)面是否被核酸污染的檢測(cè)方法。

4環(huán)境和設(shè)施要求

  1. 1環(huán)境

     

  2. 1.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充足的空間,以便所有操作過(guò)程和檢測(cè)分析能夠正常運(yùn)行,區(qū)域間應(yīng)避免相互干擾。

     

  3. 1.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)區(qū)域應(yīng)分為“清潔區(qū)”和“污染區(qū)”,進(jìn)行有效隔離并采取措施以防止核酸交叉污染。

     

  4. 1.3應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度、濕度進(jìn)行監(jiān)控并記錄。

     

  5. 2設(shè)施

     

  6. 2.1存放試劑和標(biāo)本的冰箱或者冰柜應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)的需要。

     

  7. 2.2照明和通風(fēng)設(shè)備及緊急噴淋、洗眼器等應(yīng)急設(shè)備應(yīng)與實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求相適應(yīng)。

     

  8. 2.3保存記錄的設(shè)施應(yīng)滿足檔案管理要求。使用中的記錄和存檔記錄的保存位置清晰可辨且易于查找。

     

  9. 2.4需要控制溫度的儀器應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求調(diào)節(jié)到賊佳溫度,定期對(duì)其溫度進(jìn)行監(jiān)控和記錄。

     

  10. 2.5關(guān)鍵儀器設(shè)備應(yīng)配置無(wú)間斷電源。

     

  11. 2.6設(shè)備應(yīng)由經(jīng)過(guò)授權(quán)的人員操作,專人管理。

     

  12. 2.7設(shè)備及其軟件應(yīng)有少有性標(biāo)識(shí),并保存記錄。

     

  13. 2.8儀器設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng),并保存維護(hù)、維修記錄。

     

  14. 2.9應(yīng)根據(jù)需求變化或硬件環(huán)境的變化對(duì)應(yīng)用程序進(jìn)行部分或全部的升級(jí),并對(duì)升級(jí)后的軟件進(jìn)行性能評(píng)估。依據(jù) IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)的更新,至少每年一次對(duì)本地 HLA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行更新,并針對(duì)更新后的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行性能評(píng)估。

     

  15. 3生物、化學(xué)和物理危險(xiǎn)性

     

    1. 3.1生物危險(xiǎn)性

       

    2. 所有人類標(biāo)本(包括血樣、組織等)均應(yīng)被認(rèn)作感染性的樣本來(lái)處置,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)檢測(cè)工作進(jìn)行相應(yīng)的生物安全等級(jí)備案。
    1. 3.2化學(xué)危險(xiǎn)性

       

    2. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能使用含有毒性的或致突變的化學(xué)物質(zhì)(如氯仿、溴化乙啶和苯酚),每一種化學(xué)品的使用應(yīng)遵循我國(guó)對(duì)化學(xué)品使用的相關(guān)規(guī)定。
  16. 3.3物理危險(xiǎn)性

     

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能遇到具有潛在的物理危險(xiǎn)性(如電泳儀、紫外線及離心設(shè)備),應(yīng)遵循相應(yīng)儀器的操作規(guī)則。

5試劑耗材的采購(gòu)和儲(chǔ)存

  1. 1通用要求

     

  2. 1.1應(yīng)制定并執(zhí)行檢測(cè)試劑、耗材的選擇、購(gòu)買、接收和儲(chǔ)存的程序。

     

  3. 1.2購(gòu)買的檢測(cè)試劑、耗材,驗(yàn)收合格后方可使用并保留驗(yàn)收記錄。

     

  4. 1.3應(yīng)對(duì)影響檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵耗材、試劑供應(yīng)商進(jìn)行評(píng)價(jià),保存評(píng)價(jià)記錄和供應(yīng)商名錄。

     

  5. 2試劑耗材評(píng)估

     

  6. 2.1選購(gòu)影響檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵耗材、試劑前應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,產(chǎn)品質(zhì)量應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。

     

  7. 2.2更換試劑和耗材的生產(chǎn)商應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,產(chǎn)品質(zhì)量應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。

     

  8. 2.3使用新批號(hào)試劑前,應(yīng)對(duì)新、舊批號(hào)質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)??刹捎闷叫袡z測(cè)同一樣本或質(zhì)控品的方式,新批號(hào)質(zhì)量應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。

     

  9. 2.4影響檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵耗材、試劑應(yīng)確認(rèn)合格,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室主任或者授權(quán)人審批后才投入使用。

     

  10. 3試劑的來(lái)源、制備及儲(chǔ)存

     

  11. 3.1應(yīng)記錄影響檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵耗材和試劑的來(lái)源,包括制造商、供應(yīng)商、購(gòu)買日期、購(gòu)買人、試劑批號(hào)等,且易于查詢。

     

  12. 3.2所有檢測(cè)試劑應(yīng)使用等級(jí)匹配的化學(xué)試劑配制,高效檢測(cè)試劑達(dá)到分子生物學(xué)等級(jí)水準(zhǔn)。

     

  13. 3.3應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行試劑配制,并進(jìn)行記錄。

     

  14. 3.4所有使用的試劑應(yīng)清晰標(biāo)記名稱、濃度、試劑特性、無(wú)菌狀態(tài)、試劑保存條件、配制人、配制日期或開(kāi)啟日期、試劑有效期,并清晰標(biāo)示試劑毒性。

     

  15. 3.5所有使用的商業(yè)試劑的儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與制造商提供的說(shuō)明書(shū)相一致。

     

  16. 3.6商業(yè)或者自制的試劑、水、溶液、培養(yǎng)基、質(zhì)控品、校準(zhǔn)品及其他試劑,當(dāng)超過(guò)使用效期、性質(zhì)改變或質(zhì)量下降時(shí),不應(yīng)使用。

     

  17. 3.7使用商業(yè)試劑盒應(yīng)遵循制造商的說(shuō)明書(shū)。

     

    1. 3.8應(yīng)記錄每次檢測(cè)使用試劑的批號(hào)或者貨號(hào)。

       

    2. 6樣本的采集和處理
  18. 1患者或被檢測(cè)者信息

     

  19. 1.1患者或被檢測(cè)者的送檢單信息內(nèi)容應(yīng)包括姓名、性別、出生日期(年齡)、采樣日期、樣本類型、送檢醫(yī)師姓名、臨床相關(guān)資料或?qū)嶒?yàn)室檢查資料,可酌情調(diào)整內(nèi)容。

     

  20. 1.2樣本容器上應(yīng)標(biāo)注少有性標(biāo)識(shí)。

     

  21. 1.3患者或被檢測(cè)者信息表、樣本、驗(yàn)收記錄應(yīng)歸檔保存,便于分析和追溯。

     

  22. 1.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確?;颊呋虮粰z測(cè)者信息的安全性和保密性。

     

  23. 1.5患者或被檢測(cè)者的樣本被用于科研項(xiàng)目或商業(yè)項(xiàng)目時(shí),應(yīng)經(jīng)過(guò)倫理審查和知情同意;如患者或被檢測(cè)者樣本僅進(jìn)行臨床檢測(cè),則無(wú)需填寫知情同意書(shū)。

     

  24. 2樣本采集

     

  25. 2.1樣本采集前應(yīng)明確采集方法、采集部位和保存方式,準(zhǔn)備好采集器械。采集樣本類型可為外周血、口腔拭子、骨髓細(xì)胞、唾液、組織。

     

  26. 2.2樣本采集應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作,并進(jìn)行記錄。

     

  27. 2.3采集樣本時(shí)應(yīng)注意影響樣本采集和質(zhì)量的因素,外周血推薦使用 EDTA等抗凝劑,不宜使用肝素抗凝。

     

  28. 2.4采集的樣本應(yīng)具有少有性標(biāo)識(shí),并與送檢單一一對(duì)應(yīng),可追溯患者姓名、出生日期、醫(yī)院編號(hào)或者實(shí)驗(yàn)室編號(hào)、樣本采集日期和采集時(shí)間。

     

  29. 3樣本運(yùn)輸

     

  30. 3.1樣本可以常溫或普通冰袋運(yùn)輸,防止反復(fù)凍融和污染。

     

  31. 3.2樣本應(yīng)有運(yùn)輸清單信息,包括樣本編號(hào)、采集時(shí)間、采集實(shí)驗(yàn)室、采集人、樣本數(shù)量、患者信息、運(yùn)輸容器、運(yùn)輸方式和保存方式等。

     

  32. 4樣本接收和驗(yàn)收

     

  33. 4.1接收樣本時(shí),應(yīng)做好接收驗(yàn)收記錄,包括樣本來(lái)源、類型、運(yùn)輸方法、運(yùn)輸容器、實(shí)驗(yàn)室接收樣本的日期、樣本質(zhì)量和數(shù)量、附帶資料等。

     

  34. 4.2當(dāng)樣本信息不足、樣本處理或運(yùn)輸不當(dāng)、量不能滿足檢測(cè)、抗凝方式不當(dāng),實(shí)驗(yàn)室可以拒收樣本并做好相應(yīng)記錄,通知送檢方重新送檢。

     

  35. 4.3驗(yàn)收通過(guò)的樣本應(yīng)按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行編號(hào)并存儲(chǔ)樣本信息。

     

  36. 4.4采集后的樣本可于 4℃暫存 2周,超出 2周宜在-20℃以下冰箱保存。樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融和相互污染,盡早提取核酸。

     

  37. DNA提取、檢測(cè)和保存

     

  38. 5.1樣本基因組 DNA提取

     

  39. 5.1.1可從多種類型的樣本中提取基因組 DNA,提取方法應(yīng)已獲得廣泛承認(rèn),并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。

     

  40. DNA時(shí)應(yīng)記錄所有操作步驟及試劑來(lái)源,操作步驟及試劑來(lái)源的任何變動(dòng)或?qū)嶒?yàn)過(guò)程中的任何異?,F(xiàn)象也應(yīng)記錄,操作人應(yīng)簽字并注明實(shí)驗(yàn)日期。

     

  41. 5.1.3應(yīng)設(shè)有獨(dú)立的 DNA提取操作區(qū)。操作區(qū)照明和通風(fēng)設(shè)備應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)要求,關(guān)鍵設(shè)備配置無(wú)中斷或緊急電源,并利用物理或生化手段防止污染。區(qū)域內(nèi)使用專用工作服、手套和一次性用品。

     

  42. 5.1.4DNA提取前應(yīng)驗(yàn)證所有試劑質(zhì)量以及 DNA提取系統(tǒng)。應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程提取 DNA,操作手冊(cè)置于便于取閱的地方。

     

  43. 5.1.5應(yīng)保留部分原始樣本,不應(yīng)全部用來(lái)提取 DNA,以便后續(xù)追溯和使用。

     

  44. 5.1.6DNA提取完成后應(yīng)填寫提取記錄,包括樣本編號(hào)、提取時(shí)間、提取操作人、提取方式、樣本濃度和體積等。

     

  45. 5.2DNA濃度的測(cè)定

     

  46. 5.2.1對(duì)于要求高純度核酸的檢測(cè)方法,應(yīng)對(duì)獲取的 DNA進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè),可使用分光光度計(jì)法和電泳法。

     

  47. 5.2.2分光光度計(jì)對(duì) DNA濃度測(cè)定前應(yīng)先校正,并設(shè)立合適的對(duì)照。DNA樣本被檢測(cè)時(shí),應(yīng)高效其全部溶解且濃度均勻。核酸賊大吸收波長(zhǎng)在 260 nm,1.0的光密度值相當(dāng)于雙鏈 DNA含量為 50 μg/mL;蛋白質(zhì)賊大吸收波長(zhǎng)在 280 nm處,因此測(cè)定 A260/A280比值,可判斷樣本中蛋白質(zhì)和 RNA污染的情況。比值在 1.8~2.0之間,說(shuō)明 DNA純度高;比值小于 1.6,說(shuō)明樣本中蛋白質(zhì)殘留較多;如果比值大于

     

  1. RNA污染,建議重新抽提或純化。

     

  2. 5.2.3電泳法常用來(lái)判斷 DNA的完整性和 RNA污染情況。

     

  3. 5.2.4DNA濃度、純度和完整性應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)室使用試劑的要求。若不符合后續(xù)檢測(cè)的要求,應(yīng)重新抽提。

     

  4. DNA的保存

     

基因組DNA可于4℃暫存2周,超出2周宜在-20℃以下冰箱保存。-20℃保存超過(guò)1年后再使用,應(yīng)先進(jìn)行DNA質(zhì)量評(píng)估,滿足實(shí)驗(yàn)要求方可使用。

7HLA基因分型檢測(cè)方法

  1. 1聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)方法

     

    1. 1.1基本原理

       

    2. 根據(jù)HLA基因序列的多態(tài)性,設(shè)計(jì)一系列等位基因特異性引物,通過(guò)特定的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增各等位基因的特異性DNA片段,產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶,然后通過(guò)瓊脂糖 凝膠 電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,根據(jù)是否得到PCR產(chǎn)物以及產(chǎn)物的片段大小進(jìn)行HLA基因分型。PCR-SSP的3′端引物和靶DNA特異性結(jié)合后,Taq酶使配對(duì)引物的3′端延伸,但非配對(duì)的不延伸,所以只有當(dāng)靶DNA和上下游引物全部互補(bǔ)時(shí)才能有效擴(kuò)增。PCR-SSP引物體系的特異性是通過(guò)上下游引物特異性之間的交叉來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
  2. 1.2檢測(cè)設(shè)備及引物設(shè)計(jì)

     

  3. 1.2.1必需的設(shè)備(包括但不限于):96孔 PCR板、專用貼膜;單通道移液器、多通道移液器;96孔或 384孔模塊 PCR儀;電泳系統(tǒng)及核酸片段分析系統(tǒng)。

     

  4. PCR-SSP法的 HLA基因分型技術(shù),關(guān)鍵是正確設(shè)計(jì)特異性的引物。該引物序列應(yīng)與所檢測(cè)的 HLA等位基因序列相對(duì)應(yīng),宜使用商業(yè)試劑盒。

     

  5. 1.2.3PCR引物和引物混合物宜分裝保存。

     

  6. 1.3結(jié)果分析及問(wèn)題解決方法

     

    1. 1.3.1總述

       

    2. 每個(gè)PCR-SSP反應(yīng),如果有內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增,則該反應(yīng)有效。如果一個(gè)反應(yīng)既沒(méi)有內(nèi)對(duì)照又沒(méi)有特異基因擴(kuò)增條帶,則該反應(yīng)失敗。如果一個(gè)反應(yīng)沒(méi)有內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增,即使這個(gè)等位基因在該反應(yīng)里被擴(kuò)增了,也被視為檢測(cè)失敗。等位基因的型別通過(guò)陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的格局來(lái)判別。單孔反應(yīng)失敗時(shí),應(yīng)重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
  7. 1.3.2常見(jiàn)問(wèn)題的可能原因及解決方法

     

    1. 1.3.2.1無(wú)等位基因和無(wú)內(nèi)對(duì)照片段擴(kuò)增

       

      1. PCR儀的問(wèn)題,可用確認(rèn)的 DNA樣本對(duì)檢測(cè)試劑和 PCR儀進(jìn)行驗(yàn)證;

         

      2. b) DNA的質(zhì)量不符合要求,當(dāng) DNA濃度太低,可以適當(dāng)增加 DNA模板量,或增加 Taq酶量或兩者同時(shí)增加;

         

      3. c) Taq酶可能失效,更換 Taq酶。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)正確存儲(chǔ)和使用 Taq酶。

         

    1. 1.3.2.2整體擴(kuò)增條帶顯色強(qiáng)度弱

       

      1. a) PCR儀的問(wèn)題,用確認(rèn)的 DNA樣本檢測(cè) PCR儀;

         

      2. b) DNA的質(zhì)量不符合要求,參照 7.1.3.2.1 b);

         

      3. c) Taq酶質(zhì)量低或過(guò)度稀釋。應(yīng)提高 Taq酶濃度,確保 Taq酶正確保存和使用。每個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇合適的 Taq酶濃度;

         

      4. d) PCR相關(guān)試劑未正確保存、配制及使用,應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行,必要時(shí)更換新的試劑。

         

    1. 1.3.2.3單一位點(diǎn)出現(xiàn)多個(gè)等位基因擴(kuò)增條帶

       

      1. DNA受到污染,這種污染會(huì)在多個(gè)反應(yīng)孔中產(chǎn)生額外條帶,可能出現(xiàn)兩種樣本的反應(yīng)格局,應(yīng)重新提取樣本 DNA;

         

      2. b) PCR產(chǎn)物污染,這種污染會(huì)在單個(gè)或少數(shù)檢測(cè)位點(diǎn)產(chǎn)生額外條帶,應(yīng)使用新的試劑進(jìn)行重新擴(kuò)增;

         

      3. c) 可能是新的等位基因,應(yīng)使用其他分子生物學(xué)方法進(jìn)行確認(rèn)。

         

    1. 1.3.2.4多個(gè)或所有位點(diǎn)出現(xiàn)多個(gè)等位基因擴(kuò)增條帶

       

      1. DNA受到污染,這種污染大多數(shù)會(huì)在多個(gè)或所有基因位點(diǎn)的反應(yīng)孔中產(chǎn)生額外條帶,可能出現(xiàn)兩種樣本的反應(yīng)格局,應(yīng)重新提取樣本 DNA;

         

      2. b) PCR儀加熱系統(tǒng)錯(cuò)誤,如果 PCR程序被中斷或重啟(尤其是在早期階段),可以看到多條條帶,應(yīng)對(duì) PCR儀進(jìn)行檢修和校準(zhǔn);

         

      3. PCR反應(yīng)液受到污染,應(yīng)重新采集樣本或配制新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

         

    1. 1.3.2.5一個(gè)基因位點(diǎn)上無(wú)特異性擴(kuò)增條帶

       

      1. a) PCR反應(yīng)液配制錯(cuò)誤,應(yīng)確保所有的 PCR反應(yīng)組份在使用前經(jīng)過(guò)驗(yàn)證;

         

      2. dNTP( 脫氧核糖核苷 三磷酸)與 MgCl 2的比#20363;不合適,可影響一個(gè)或更多基因位點(diǎn)的擴(kuò)增,表現(xiàn)出在一個(gè)特殊的位點(diǎn)沒(méi)有等位基因,可調(diào)整 dNTP與 MgCl 2比例進(jìn)行再次測(cè)試;

         

      3. c) 如果某些等位基因有較高的 G/C含量,可因 Taq酶選擇不當(dāng)導(dǎo)致難以擴(kuò)增。應(yīng)更換合適的 Taq酶。

         

    1. 1.3.2.6有等位基因擴(kuò)增條帶但無(wú)內(nèi)對(duì)照條帶

       

      1. a) DNA降解,使分子量大的擴(kuò)增條帶難以產(chǎn)生,如內(nèi)對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶,應(yīng)重新提取樣本 DNA;

         

      2. b) PCR延伸時(shí)間不足,應(yīng)增加 PCR反應(yīng)延伸時(shí)間;

         

      3. c) PCR儀故障,應(yīng)重新校準(zhǔn) PCR儀;

         

      4. d) 內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增引物濃度過(guò)低,應(yīng)提高引物濃度。

         

    1. 1.3.2.7有內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增條帶但無(wú)等位基因條帶

       

      1. a) 鎂離子濃度過(guò)高,應(yīng)重新配制 PCR擴(kuò)增試劑;

         

      2. b) PCR儀蓋壓力不夠,應(yīng)確保 PCR儀蓋和 PCR管/板之間的壓力匹配。

         

    1. 1.3.2.8部分分型結(jié)果清晰,部分分型結(jié)果失敗

       

      1. a) PCR儀加熱系統(tǒng)故障,應(yīng)確保 PCR儀加熱模塊的一致性;

         

      2. PCR儀加熱模塊不匹配,應(yīng)確保 PCR管/板的底部直接接觸 PCR儀加熱模塊;

         

      3. c) PCR儀蓋壓力不均勻,應(yīng)確保 PCR儀蓋和 PCR管/板之間的壓力匹配;

         

      4. d) 凝膠電泳時(shí)核酸染料沒(méi)有混合均勻或濃度不足,應(yīng)重新配制凝膠或核酸染料溶液。

         

    1. 1.4檢測(cè)方法的局限性

       

    2. 基于已知序列信息的分型方法可能檢測(cè)不到新的等位基因,或者無(wú)法與已知等位基因相區(qū)別,為避免漏檢新的等位基因,當(dāng)使用PCR-SSP方法時(shí),可采用多種引物,以提高檢測(cè)到新等位基因的可能性。
  8. -序列特異性寡核苷酸雜交(polymerase chain reaction-sequence specificoligonucleotide,PCR-SSO)方法

     

  9. 2.1基本原理

     

PCR-SSO方法首先是對(duì)HLA的多態(tài)性區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,然后根據(jù) 堿基配對(duì) 原則使用特異性探針進(jìn)行雜交,根據(jù)雜交信號(hào)判斷結(jié)果?;赑CR-SSO技術(shù)的HLA分型方法主要包括正相SSO方法和反相SSO方法兩種。PCR-SSO技術(shù)具有 靈敏度 高、特異性強(qiáng)、加樣量少的特點(diǎn)。

2000年后基于流式熒光檢測(cè)儀Luminex平臺(tái)的PCR-SSO基因分型檢測(cè)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)成功,它利用 傳統(tǒng) PCR-SSO的原理,首先對(duì)樣本的HLA多態(tài)性區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)解鏈后與 包被 在微珠上的特異性 針雜交結(jié)合,通過(guò)Luminex流式熒光檢測(cè)儀檢測(cè),確定HLA分型結(jié)果。該系統(tǒng)是 整合 了熒光編碼微珠、激光檢測(cè)、應(yīng)用流體力學(xué)、高速數(shù)字信號(hào)和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法等多項(xiàng)技術(shù)的高通量檢測(cè)平臺(tái)。7.2主要針對(duì)Luminex平臺(tái)的PCR-SSO HLA基因分型檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行說(shuō)明和要求。

    1. 2.2必需的設(shè)備與耗材(包括但不限于)

       

    2. 96孔PCR板、96孔雜交板、96孔讀取板、專用貼膜,單通道移液器、多道移液器,96孔PCR儀、Luminex分析儀,平板離心機(jī),電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)。
  1. 2.3PCR引物和雜交探針的設(shè)計(jì)

     

  2. 2.3.1PCR擴(kuò)增引物一般至少針對(duì) HLA Ⅰ類基因(HLA-A, HLA-B,HLA-C)的 2號(hào)外顯子和 3號(hào)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增,至少針對(duì) HLA Ⅱ類基因(HLA-DRB1,HLA-DQB1)的 2號(hào)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。

     

  3. PCR-SSO法的 HLA基因分型技術(shù)的關(guān)鍵是正確地設(shè)計(jì)特異性雜交探針,該探針序列應(yīng)與所檢測(cè)的 HLA等位基因序列相匹配。

     

  4. 2.3.3PCR引物應(yīng)于-20℃保存,包被探針的微珠應(yīng)避免反復(fù)凍融、劇烈震蕩,按廠家說(shuō)明書(shū)要求條件保存。

     

  5. 2.4結(jié)果分析及問(wèn)題解決方法

     

    1. 2.4.1總述

       

    2. 對(duì)于每個(gè)PCR-SSO反應(yīng),如果內(nèi)對(duì)照雜交信號(hào)達(dá)到閾值,可認(rèn)為反應(yīng)有效;如內(nèi)對(duì)照和特異等位基因雜交信號(hào)均未達(dá)到閾值,可認(rèn)為反應(yīng)失敗;如內(nèi)對(duì)照雜交信號(hào)未達(dá)到閾值,即使特異等位基因雜交信號(hào)達(dá)到閾值,也認(rèn)為反應(yīng)失敗。
  6. 2.4.2常見(jiàn)問(wèn)題可能原因及解決方法

     

    1. 2.4.2.1擴(kuò)增反應(yīng)失?。娪撅@示無(wú)擴(kuò)增條帶)

       

      1. PCR儀的問(wèn)題,用確認(rèn)的 DNA樣本對(duì)檢測(cè)試劑和 PCR儀進(jìn)行驗(yàn)證;

         

      2. b) DNA的質(zhì)量不符合要求,DNA濃度太低,可以適當(dāng)增加 DNA模板量,或增加 Taq酶量或兩者同時(shí)增加,如果凝膠成像顯示 DNA條帶正常,可能是 DNA純度差的原因,需要重新提取 DNA。

         

    1. 2.4.2.2微珠讀取數(shù)量未達(dá)到閾值

       

      1. a) Luminex儀器進(jìn)樣針堵塞,應(yīng)對(duì)儀器進(jìn)行檢修;

         

      2. b) 微珠混合不均勻,應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行;

         

      3. c) 微珠的保存條件不正確,應(yīng)按廠家說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行保存。

         

    1. 2.4.2.3雜交熒光信號(hào)出現(xiàn)假陰性或未達(dá)到閾值

       

      1. a) PCR反應(yīng)擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增反應(yīng)弱,應(yīng)參照 7.2.4.2.1的解釋;

         

      2. Luminex儀器的問(wèn)題,用確認(rèn)的 DNA樣本對(duì)檢測(cè)試劑和 Luminex儀器進(jìn)行驗(yàn)證;

         

      3. c) 雜交試劑的保存、配制以及雜交后洗滌條件不當(dāng),應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

         

    1. 2.4.2.4雜交熒光信號(hào)出現(xiàn)假陽(yáng)性

       

      1. a) DNA純度和濃度沒(méi)有達(dá)到要求,應(yīng)參照 7.2.4.2.1 b)的解釋;

         

      2. b) PCR擴(kuò)增反應(yīng)中 Taq酶過(guò)量,應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行;

         

      3. Luminex儀器的問(wèn)題,用確認(rèn)的 DNA樣本對(duì)檢測(cè)試劑和 Luminex儀器進(jìn)行驗(yàn)證;

         

      4. d) 雜交過(guò)程中未充分混勻、孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、熒光染料過(guò)量、洗板后孔內(nèi)上清殘留過(guò)多,應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

         

    1. 2.5檢測(cè)方法的局限性

       

    2. 基于已知序列信息的分型方法可能檢測(cè)不到新的等位基因,或者無(wú)法與已知等位基因相區(qū)別,為避免漏檢新的等位基因,當(dāng)使用PCR-SSO方法時(shí),可以加大探針的種類和數(shù)量,以提高檢測(cè)到潛在的新的等位基因的可能性。
  7. 3基于直接測(cè)序法(sequence-based typing,SBT)

     

    1. 3.1基本原理

       

    2. 基于SBT的HLA基因分型檢測(cè)是對(duì)DNA序列進(jìn)行直接測(cè)序,通過(guò)與國(guó)際HLA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析,獲得HLA等位基因型別的分析方法。任何DNA直接序列測(cè)定的方法均可用于HLA基因分型檢測(cè),該方法是賊高效的HLA基因分型方法,可正確確定新的HLA等位基因。
    1. 3.2必需的設(shè)備(包括但不限于)

       

    2. PCR儀、DNA測(cè)序儀、HLA基因分型軟件、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
  8. 3.3PCR擴(kuò)增引物及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)

     

  9. 3.3.1PCR擴(kuò)增引物一般針對(duì) HLA Ⅰ類基因和 HLA Ⅱ類基因的各外顯子進(jìn)行擴(kuò)增,宜使用商業(yè)試劑盒。

     

  10. 3.3.2測(cè)序引物一般根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)域決定,可使用商業(yè)試劑盒。

     

  11. 3.3.3引物和測(cè)序試劑應(yīng)分裝保存。

     

  12. 3.4結(jié)果分析及問(wèn)題的解決方法

     

    1. 3.4.1總述

       

    2. 以Sanger雙脫氧鏈終止法為代表的先進(jìn)代測(cè)序方法應(yīng)用較為廣泛,本條內(nèi)容主要針對(duì)采用先進(jìn)代測(cè)序技術(shù)的HLA基因分型檢測(cè)方法進(jìn)行說(shuō)明和要求。
  13. 3.4.2常見(jiàn)問(wèn)題可能原因及解決方法

     

    1. 3.4.2.1無(wú)序列峰圖信號(hào)

       

      1. a) 測(cè)序模板未能有效擴(kuò)增,應(yīng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析,確定是否有足量特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,如擴(kuò)增產(chǎn)物存在問(wèn)題,應(yīng)重新擴(kuò)增;

         

      2. b) 測(cè)序引物選擇存在問(wèn)題,應(yīng)核對(duì)加入引物的種類及加入量是否正確;

         

      3. c) 測(cè)序試劑配制、保存存在問(wèn)題,每一步驟應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

         

    1. 3.4.2.2測(cè)序背景信號(hào)高

       

      1. a) 測(cè)序模板加入量沒(méi)有達(dá)到要求,應(yīng)重新調(diào)整測(cè)序模板加入量;

         

      2. b) 測(cè)序模板純度(擴(kuò)增條帶特異性差或 PCR抑制劑過(guò)多)沒(méi)有達(dá)到要求,應(yīng)重新純化和擴(kuò)增測(cè)序模板。

         

    1. 3.4.2.3雜峰信號(hào)過(guò)多

       

      1. PCR反應(yīng)液污染,應(yīng)重新進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè);

         

      2. b) 測(cè)序模板加入量偏少,測(cè)序信號(hào)值偏低,應(yīng)調(diào)整測(cè)序模板加入量;

         

      3. c) 測(cè)序引物特異性或延伸效率較差,應(yīng)重新設(shè)計(jì)或合成測(cè)序引物;

         

      4. d) 存在堿基插入或缺失區(qū)段,應(yīng)進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增測(cè)序或克隆測(cè)序鑒定;

         

      5. e) GC含量過(guò)高,測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)效率過(guò)低,應(yīng)調(diào)整測(cè)序 PCR程序或調(diào)整測(cè)序反應(yīng)體系。

         

  14. 3.5檢測(cè)方法的局限性

     

由于HLA具有高度多態(tài)性,在分型時(shí)測(cè)序區(qū)域有時(shí)會(huì)出現(xiàn)序列組合形式上有效相同的情況,這種情況既可能是由于兩個(gè)或多個(gè)等位基因在所檢測(cè)區(qū)域序列一致(兩者差異在所檢測(cè)區(qū)域之外),又可能是由于該測(cè)序區(qū)域存在相同的等位基因組合,此時(shí)應(yīng)擴(kuò)大檢測(cè)區(qū)域或采用等位基因選擇性擴(kuò)增的方法進(jìn)行

分型。

8質(zhì)量控

    1. 1原則和目的

       

    2. 檢測(cè)結(jié)果的正確性和高效性依賴于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制,質(zhì)量控制包括對(duì)試劑、人員技能和設(shè)備儀器性能的質(zhì)量控制。試劑包括檢測(cè)用的任何化學(xué)或生物制品,對(duì)試劑的正確標(biāo)記、保存、配制和使用都非常重要,試劑使用不當(dāng)可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的高效性甚至對(duì)檢測(cè)人員的健康和安全構(gòu)成威脅。對(duì)人員的培訓(xùn)、儀器的校準(zhǔn)、維護(hù)維修也是質(zhì)量控制的組成部分。實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)至少參加一項(xiàng)能力驗(yàn)證/室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(Proficiency Testing/External Quality Assessment, PT/EQA)項(xiàng)目,如果沒(méi)有PT/EQA組織機(jī)構(gòu)能夠提供對(duì)該項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與其它實(shí)驗(yàn)室建立平行檢測(cè)比較,至少每6個(gè)月一次。
  1. 2人員檢測(cè)能力考核評(píng)估

     

  2. 2.1實(shí)驗(yàn)室主任、技術(shù)主管及檢測(cè)人員應(yīng)參與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目相關(guān)的繼續(xù)教育。

     

  3. 2.2實(shí)驗(yàn)室主任和技術(shù)主管應(yīng)建立檢測(cè)人員技能評(píng)估的計(jì)劃和程序文件,至少每年對(duì)相關(guān)人員的技能進(jìn)行一次評(píng)估并記錄。

     

  4. 2.3實(shí)驗(yàn)室主任和技術(shù)主管應(yīng)對(duì)檢測(cè)人員的檢測(cè)能力進(jìn)行考核并記錄。先進(jìn)年至少考核兩次,一年后每年至少考核一次,每當(dāng)檢測(cè)方法或者儀器發(fā)生變更時(shí)考核一次,離崗 6個(gè)月及以上人員再上崗前應(yīng)增加考核一次。

     

  5. 2.4實(shí)驗(yàn)室主任和技術(shù)主管應(yīng)每年至少一次向檢測(cè)人員發(fā)放相應(yīng)的特定質(zhì)控物作為盲樣,以驗(yàn)證檢測(cè)人員對(duì)相應(yīng)質(zhì)控物的檢測(cè)能力。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保留每位檢測(cè)人員的驗(yàn)證結(jié)果至少兩年。

     

    1. 2.5檢測(cè)能力考核評(píng)估記錄應(yīng)包括以下內(nèi)容:

       

      1. a) 常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目操作的規(guī)范性,包括樣本的準(zhǔn)備、處理和檢測(cè);

         

      2. b) 實(shí)驗(yàn)記錄的完整性、真實(shí)性;

         

      3. c) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性;

         

      4. d) 儀器保養(yǎng)和操作的正確性;

         

      5. e) 質(zhì)控記錄、PT/EQA結(jié)果、儀器維護(hù)記錄的完整性;

         

      6. f) 通過(guò)已檢測(cè)樣本、室內(nèi)盲樣、室間質(zhì)評(píng)樣本評(píng)估其檢測(cè)能力;

         

      7. g) 綜合評(píng)估其解決問(wèn)題的能力。

         

  6. 3試劑質(zhì)量控制

     

  7. 3.1試劑標(biāo)記

     

  8. 3.2供貨商評(píng)價(jià)

     

  9. 3.2.1建立實(shí)驗(yàn)室承認(rèn)的供貨商評(píng)價(jià)系統(tǒng),供貨商資格滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求。

     

  10. 3.2.2建立合同審計(jì)制度。

     

  11. 3.2.3建立供貨商所提供試劑的質(zhì)量證明和質(zhì)控報(bào)告記錄檔案。

     

  12. 3.3試劑管理

     

  13. 3.3.1建立實(shí)驗(yàn)室常用試劑清單,包括但不限于以下內(nèi)容:試劑名稱/化學(xué)式、毒性、制造商和貨號(hào)、制備要求、儲(chǔ)存要求。

     

  14. 3.3.2建立實(shí)驗(yàn)室試劑使用記錄/質(zhì)控記錄,包括但不限于以下內(nèi)容:試劑名稱、批號(hào)、接收日期、使用期限、配制日期或開(kāi)啟日期、配制人或開(kāi)啟人簽名。

     

  15. 3.3.3所有過(guò)失效期的試劑應(yīng)廢棄。

     

  16. 3.3.4商業(yè)試劑盒不同批號(hào)間的試劑不應(yīng)混用,除非制造商經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。

     

  17. 3.3.5建立實(shí)驗(yàn)室試劑庫(kù)存清單,以高效檢測(cè)期間試劑的供應(yīng),試劑庫(kù)存清單應(yīng)包括但不限于以下內(nèi)容:上一批訂購(gòu)量、訂貨周期、賊小庫(kù)存量。

     

  18. 3.4試劑性能記錄

     

  19. 3.4.1每種試劑在用于檢測(cè)前,都應(yīng)滿足其賊低標(biāo)準(zhǔn)要求。

     

  20. 3.4.2每批新試劑用于檢測(cè)前,應(yīng)檢測(cè)其性能指標(biāo),應(yīng)與現(xiàn)用試劑具有同等質(zhì)量、達(dá)到同樣性能標(biāo)準(zhǔn)。

     

  21. 3.4.3當(dāng)試劑性能指標(biāo)超出可接受誤差范圍時(shí),應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)并上報(bào)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)主管。

     

    1. 3.5試劑質(zhì)控的程序

       

    2. 應(yīng)制定試劑質(zhì)控程序,詳細(xì)說(shuō)明質(zhì)控過(guò)程,質(zhì)控記錄應(yīng)存檔。該記錄內(nèi)容應(yīng)包括試劑性能的可接受范圍和與歷史數(shù)據(jù)的比對(duì)。對(duì)于HLA基因分型,試劑質(zhì)控主要針對(duì)引物和探針的特異性。
    1. 3.6試劑不能使用的原則

       

    2. 新批號(hào)試劑檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不符,不同批號(hào)試劑平行檢測(cè)中新批號(hào)試劑結(jié)果偏離較大,試劑造成質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤,試劑中發(fā)現(xiàn)有污染。
  22. 3.7引物的質(zhì)量控制(SSP方法)

     

  23. DNA陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè) SSP引物陽(yáng)性反應(yīng)的特異性。若 SSP板先進(jìn)孔是 DRB1*01特異的引物,則加入包含 DRB1*01的 DNA質(zhì)控品;SSP板的每一孔都應(yīng)加入相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性 DNA質(zhì)控品。質(zhì)控品可為已知分型的純合或雜合細(xì)胞株,也可使用已分型的患者或 PT/EQA樣本;陽(yáng)性板的每個(gè)反應(yīng)孔都應(yīng)出現(xiàn)正確的特異性條帶,對(duì)于多基因型 SSP特異性引物,應(yīng)用多個(gè)相對(duì)應(yīng)的 DNA陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行評(píng)價(jià)。

     

  24. DNA質(zhì)控品用于評(píng)估引物的陰性特異性。用兩個(gè)以上陰性 DNA質(zhì)控品對(duì) SSP板做檢測(cè),陰性反應(yīng)孔應(yīng)只有內(nèi)參條帶出現(xiàn);陰性質(zhì)控品應(yīng)選擇與引物特異性非常接近的 DNA質(zhì)控品,特別應(yīng)針對(duì)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的 SSP引物。

     

  25. 3.7.3為整體評(píng)估 SSP全套引物的特異性,應(yīng)對(duì) DNA質(zhì)控品做全套引物的完整分型,觀察、確認(rèn)非特異性條帶和/或交叉反應(yīng)出現(xiàn)。

     

  26. 3.7.4應(yīng)高效所用試劑質(zhì)量滿足檢測(cè)要求。

     

  27. 3.8探針的質(zhì)量控制

     

  28. 3.8.1SSO探針標(biāo)記的質(zhì)量控制

     

  29. 3.8.1.1每條探針標(biāo)記后,需用 DNA質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè),高效其敏感性和特異性。

     

  30. 3.8.1.2檢測(cè)結(jié)果應(yīng)記錄在“探針質(zhì)控工作表”中。

     

  31. 3.8.1.3推薦每次進(jìn)行 SSO分型時(shí),同時(shí)包含 DNA質(zhì)控品。

     

  32. SSO質(zhì)量控制

     

  33. 3.8.2.1實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的反向 SSO,新批號(hào)的試劑應(yīng)通過(guò)有效 DNA質(zhì)控品的確認(rèn),以高效每條探針的特異性。

     

  34. 3.8.2.2商業(yè)試劑盒用于患者樣本檢測(cè)前,應(yīng)先用 DNA質(zhì)控品進(jìn)行評(píng)價(jià)。試劑使用過(guò)程中,應(yīng)定期用 DNA質(zhì)控品監(jiān)測(cè)探針的特異性。

     

  35. 4設(shè)備的維護(hù)和校準(zhǔn)

     

  36. PCR儀、孵育箱、冰箱和水浴箱的溫度,用于監(jiān)控的溫度計(jì)使用前應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)。

     

  37. 4.2PCR儀反應(yīng)孔的溫度正確性和一致性應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定孔間實(shí)際溫度偏差和預(yù)期溫度偏差的可接受范圍。

     

  38. 4.3移液器應(yīng)至少每年校準(zhǔn)一次,移液器的使用和清潔應(yīng)參照制造商的說(shuō)明書(shū)。

     

  39. 4.4測(cè)序儀等大型設(shè)備應(yīng)制定日常維護(hù)的操作程序、日常維護(hù)檢查時(shí)間表,并記錄維護(hù)檢查結(jié)果,保存在維護(hù)手冊(cè)中。

     

  40. 4.5應(yīng)制定設(shè)備維護(hù)檢查結(jié)果的可接受范圍,當(dāng)結(jié)果超出可接受范圍時(shí)采取糾正措施,包括但不限于以下:記錄故障發(fā)現(xiàn)過(guò)程、記錄儀器維修過(guò)程、將詳細(xì)故障告知相關(guān)人員、啟用備用程序和備用儀器。

     

  41. 4.6設(shè)備故障維修后應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證滿足檢測(cè)性能后,方可重新投入使用,并追溯評(píng)估故障前賊后一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

     

  42. 5PT/EQA項(xiàng)目

     

  43. 5.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加由授權(quán)機(jī)構(gòu)組織的 PT/EQA項(xiàng)目。

     

  44. PT/EQA結(jié)果回報(bào)賊后期限前,實(shí)驗(yàn)室不應(yīng)以任何形式與其他實(shí)驗(yàn)室交流 PT/EQA樣本的檢測(cè)結(jié)果。如實(shí)驗(yàn)室主任管轄范圍內(nèi)多個(gè)分支實(shí)驗(yàn)室同時(shí)參與 PT/EQA項(xiàng)目,應(yīng)避免各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的交流。

     

  45. 5.3實(shí)驗(yàn)室不應(yīng)將本實(shí)驗(yàn)室的 PT/EQA樣本送至其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè),也不應(yīng)將檢測(cè)結(jié)果傳至其他實(shí)驗(yàn)室。

     

  46. 5.4以對(duì)待常規(guī)臨床樣本的方式對(duì)待 PT/EQA樣本,所有檢測(cè)人員應(yīng)參與 PT/EQA樣本的檢測(cè)。

     

  47. 5.5實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì) PT/EQA樣本的接收、保存、準(zhǔn)備、處理、操作和檢測(cè)過(guò)程中的每一步驟及結(jié)果報(bào)告進(jìn)行記錄并歸檔。與 PT/EQA有關(guān)的各項(xiàng)記錄的復(fù)印件至少在實(shí)驗(yàn)室保存兩年,其中包括 PT/EQA樣本檢測(cè)結(jié)果回報(bào)表的復(fù)印件、所有與 PT/EQA組織單位就樣本檢測(cè)的交流記錄、實(shí)驗(yàn)室主任或技術(shù)主管對(duì)每次的 PT/EQA樣本檢測(cè)或相關(guān)整改措施的審核報(bào)告的復(fù)印件。

     

  48. PT/EQA不合格時(shí),應(yīng)調(diào)查和分析引起錯(cuò)誤的原因,實(shí)施相應(yīng)的整改措施并同時(shí)記錄歸檔。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)緊急采取整改措施,確認(rèn)同類錯(cuò)誤未發(fā)生在臨床樣本檢測(cè)報(bào)告中。

     

  49. 6DNA污染的控制

     

    1. 6.1原則和目的

       

    2. 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以將DNA片段擴(kuò)增到百萬(wàn)倍甚至更多,但由于擴(kuò)增產(chǎn)物可以在后續(xù)PCR循環(huán)里再次被擴(kuò)增,因而使用PCR技術(shù)的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)就是擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)室污染。PCR實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量高效體系的一個(gè)重要部分就是監(jiān)控DNA污染。DNA污染可來(lái)自基因組DNA和擴(kuò)增產(chǎn)物,均可導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果,從而造成實(shí)驗(yàn)報(bào)告錯(cuò)誤。因此,HLA基因分型實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行DNA污染的常規(guī)監(jiān)測(cè)。
  50. 6.2實(shí)驗(yàn)室布局和工作流程

     

檢測(cè)試劑應(yīng)按5.3中的要求進(jìn)行標(biāo)記。

實(shí)驗(yàn)室試劑配制、樣本制備、擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)應(yīng)分別在3~4個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,可根據(jù)方法適當(dāng)調(diào)整區(qū)域數(shù)量。應(yīng)符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》的要求。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立單向工作流程,使用單向工作流程可減少污染的發(fā)生。

    1. 6.3實(shí)驗(yàn)服和手套

       

    2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況,宜在試劑配制區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增和檢測(cè)區(qū)分別配備專用實(shí)驗(yàn)服,出入各區(qū)時(shí)更換。為減少潔凈區(qū)污染,每次進(jìn)入試劑配制區(qū)時(shí)應(yīng)配戴或更換新手套。
  1. 6.4移液器

     

    1. 6.5試劑

       

    2. 所有用于核酸擴(kuò)增的試劑應(yīng)配制后分裝,并與樣本或擴(kuò)增產(chǎn)物分開(kāi)存放,以減少取樣次數(shù),降低污染風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)記錄試劑批號(hào),一旦發(fā)生污染,可以追溯污染源。
    1. 6.6加樣

       

    2. 在開(kāi)蓋前宜將反應(yīng)管快速離心,小心開(kāi)蓋以防氣溶膠形成。應(yīng)在反應(yīng)管中先加入非樣本反應(yīng)組分(如dNTPs、引物、緩沖液、酶),再加入樣本,每加完一個(gè)樣本要蓋好蓋后再加下一個(gè)樣本。
  2. 7對(duì)照反應(yīng)

     

  3. 7.1每次檢測(cè)應(yīng)同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

     

  4. 7.2陽(yáng)性對(duì)照是包含已知的 DNA模板,其目的為證明擴(kuò)增反應(yīng)體系可正常工作。

     

  5. 7.3陰性對(duì)照即為反應(yīng)物空白對(duì)照,該對(duì)照包含正常反應(yīng)除模板 DNA外的所有試劑,其目的是檢測(cè)有無(wú)模板 DNA的污染。

     

  6. 8擴(kuò)增產(chǎn)物的滅活方法

     

  7. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的滅活方法

     

  8. 8.1.1酶滅活法:在擴(kuò)增時(shí)用 dUTP代替 dTTP參與 PCR反應(yīng),生成 dU化的擴(kuò)增產(chǎn)物,這種產(chǎn)物由于存在“非自然”狀態(tài)下的堿基而與靶 DNA相區(qū)別。細(xì)菌的尿嘧啶糖苷酶(UNG)加入反應(yīng)混合物,上次擴(kuò)增的 dU化的 PCR產(chǎn)物就會(huì)被 UNG降解,不會(huì)作為下一次擴(kuò)增的模板。

     

  9. 8.1.2局部滅活方案:可使用含氯漂白劑(例如次氯酸鈉)清潔工作臺(tái)面等,以清除殘留的 PCR產(chǎn)物或者其他污染源,用紫外燈照射工作臺(tái)面也是控制污染的有效措施。

     

    1. 8.2擴(kuò)增產(chǎn)物滅活方法的實(shí)施

       

    2. 確定擴(kuò)增產(chǎn)物滅活方法后應(yīng)建立相應(yīng)的驗(yàn)證方法。酶滅活法應(yīng)用稀釋的PCR產(chǎn)物人為“污染”反應(yīng)液,然后分析滅活效果,以評(píng)價(jià)滅活方法的有效性。如果實(shí)驗(yàn)室需要更換另一種滅活方法,應(yīng)在更換前對(duì)新方法進(jìn)行評(píng)價(jià),并證實(shí)新方法的有效性。
    1. 9擦拭檢測(cè)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室污染

       

    2. 開(kāi)展HLA基因分型的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過(guò)常規(guī)擦拭檢測(cè)(wipe test)、陰性對(duì)照、開(kāi)管對(duì)照等途徑來(lái)監(jiān)測(cè)DNA污染或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。擦拭檢測(cè)用于檢查實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和臺(tái)面是否被DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染,對(duì)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的區(qū)域需采取適當(dāng)?shù)恼拇胧?
  10. 9.1擦拭檢測(cè)實(shí)施措施

     

  11. 9.1.1用實(shí)驗(yàn)室賊常見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增試劑常規(guī)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增前區(qū)域的污染情況。

     

  12. 9.1.2監(jiān)測(cè)潛在的污染,使用的方法應(yīng)達(dá)到常規(guī)檢測(cè)方法的靈敏度,且使用合適的引物。每次擴(kuò)增至少包括一個(gè)陰性對(duì)照和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。

     

  13. 9.1.3每次擦拭檢測(cè)宜包括污染監(jiān)測(cè)反應(yīng)和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)。

     

  14. 9.1.4如果檢測(cè)到 PCR抑制的存在,應(yīng)采取清潔措施排除 PCR抑制物的干擾,并重復(fù)檢測(cè),確認(rèn)抑制物被有效清除。

     

  15. 9.1.5如果檢測(cè)到污染的存在,應(yīng)采取清潔措施清除污染源,并重復(fù)檢測(cè),確認(rèn)污染源被有效清除。

     

  16. 9.2污染監(jiān)測(cè)體系的建立

     

  17. 9.2.1針對(duì)Ⅰ類和Ⅱ類基因擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的非多態(tài)區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,此引物能檢測(cè)到所有的 PCR產(chǎn)物和基因組 DNA污染。

     

  18. 9.2.2建立并確認(rèn) PCR方法的擦拭檢測(cè)步驟。

     

  19. DNA或稀釋的 PCR產(chǎn)物(作為摻入樣本對(duì)照),應(yīng)確認(rèn)擦拭檢測(cè)引物對(duì)所用分型方法產(chǎn)生的 PCR產(chǎn)物是有效的,反應(yīng)液不含有干擾或抑制 Taq聚合酶活性的外來(lái)雜質(zhì)。

     

  20. 9.2.4根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳有無(wú) PCR產(chǎn)物,記錄“+”或“-”。

     

    1. 1總述

       

    2. 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供及時(shí)、正確、清晰、高效和客觀的檢測(cè)報(bào)告,檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包括客戶的要求、檢測(cè)方法等內(nèi)容。在為內(nèi)部客戶或有書(shū)面協(xié)議的客戶檢測(cè)時(shí)可用簡(jiǎn)化的報(bào)告方式。檢測(cè)報(bào)告可用紙版或電子版形式發(fā)布。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確保檢測(cè)報(bào)告的保密性。
    1. 2檢測(cè)報(bào)告的內(nèi)容和格式

       

    2. 檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包含但不局限于以下內(nèi)容:患者姓名、性別、出生日期、標(biāo)本采集日期、標(biāo)本號(hào)或病例號(hào)、樣本實(shí)驗(yàn)室編碼和少有標(biāo)識(shí)、檢測(cè)方法的簡(jiǎn)單描述、檢測(cè)結(jié)果及解釋、報(bào)告日期、報(bào)告單編號(hào)、實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或其他授權(quán)人員的簽名、實(shí)驗(yàn)室的名稱、地址和電話,檢測(cè)報(bào)告應(yīng)標(biāo)有頁(yè)碼和總頁(yè)數(shù)。報(bào)告內(nèi)容可根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整。
  21. 2.1檢測(cè)報(bào)告的格式

     

  22. 2.1.1檢測(cè)報(bào)告的格式應(yīng)適用于各種檢測(cè)類型,減少產(chǎn)生誤解或誤用的可能性。應(yīng)注意檢測(cè)報(bào)告的排版,使檢測(cè)數(shù)據(jù)的表達(dá)方式易于理解。檢測(cè)報(bào)告的表頭應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。

     

  23. 2.1.2報(bào)告格式的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮所有可能出現(xiàn)的檢測(cè)結(jié)果,高效與相關(guān)指南或規(guī)定的要求相一致。檢測(cè)報(bào)告的格式應(yīng)包括但不局限于以下因素:關(guān)鍵信息應(yīng)突出顯示或重復(fù)描述、表達(dá)方式清晰(如提供范圍、閾值)、用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)算的信息、免責(zé)聲明或?qū)z測(cè)局限性的說(shuō)明(如分析有效性、臨床有效性、非親子關(guān)系等)。

     

  24. 2.2檢測(cè)報(bào)告的解釋

     

  25. 2.2.1檢測(cè)報(bào)告中應(yīng)給出檢測(cè)結(jié)果的解釋說(shuō)明。

     

  26. 2.2.2宜采用 IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)解釋數(shù)據(jù)。

     

  27. 2.2.3檢測(cè)結(jié)果的解釋應(yīng)清晰、易于理解,便于非 HLA專業(yè)的醫(yī)生閱讀。

     

  28. 2.2.4對(duì)檢測(cè)報(bào)告中未予解釋而客戶要求解釋的部分,應(yīng)由臨床咨詢醫(yī)師或其他實(shí)驗(yàn)室授權(quán)人員做出口頭或書(shū)面的解釋。

     

  29. 3檢測(cè)報(bào)告的發(fā)放

     

  30. 3.1檢測(cè)報(bào)告應(yīng)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室主任或技術(shù)主管或其他授權(quán)人的審核和承認(rèn)后發(fā)放。

     

  31. 3.2實(shí)驗(yàn)室提供的檢測(cè)報(bào)告可以是紙版或電子版形式,但只能將檢測(cè)報(bào)告發(fā)放給檢測(cè)申請(qǐng)者或其指定人員。

     

  32. 3.3當(dāng)用傳真的形式發(fā)放報(bào)告時(shí)應(yīng)確保傳真件與Ö#21407;始紙版報(bào)告內(nèi)容一致。傳真封面的收件人應(yīng)為申請(qǐng)者或其指定人員。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用封面提示注明傳真內(nèi)容包含保密信息,受法律保護(hù)。

     

  33. 3.4通過(guò)電話發(fā)放報(bào)告不能高效信息的隱私保護(hù),應(yīng)限制或禁止使用電話方式傳遞信息。

     

    1. 4檢測(cè)報(bào)告的修改

       

    2. 對(duì)已發(fā)放的檢測(cè)報(bào)告進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修改,應(yīng)僅采用追加文件或資料更換的形式,并包括如下說(shuō)明:“對(duì)某某檢測(cè)報(bào)告的補(bǔ)充,報(bào)告單編號(hào)等”,或其他等效的文字形式。如要發(fā)布全新的檢測(cè)報(bào)告,應(yīng)標(biāo)注少有性標(biāo)識(shí),并注明所替代的原件。
  34. 5檢測(cè)報(bào)告的保存

     

  35. 5.1每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定其檢測(cè)報(bào)告的保存時(shí)間、文件目錄和文件類型。

     

  36. 5.2所有患者的檢測(cè)報(bào)告,應(yīng)易于通過(guò)患者少有性標(biāo)識(shí)(如實(shí)驗(yàn)室檢索號(hào)碼或病例號(hào))檢索。

     

  37. 5.3所有檢測(cè)報(bào)告均應(yīng)妥善保管,并高效資料的保密性和完整性。

     

  38. 5.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保留檢測(cè)報(bào)告至少 5年,與家系有關(guān)的遺傳檢測(cè)的重要記錄通常至少應(yīng)保存一代(20年)。

     

試劑配制區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增和檢測(cè)區(qū)應(yīng)分別配備專用移液器。應(yīng)使用帶濾芯吸頭以防移液器管腔被氣溶膠污染。所有移液器應(yīng)定期清洗。

9檢測(cè)報(bào)告10記錄管理

    1. 1總述

       

    2. 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立收集、索引、存取、保存、維護(hù)和清理檢測(cè)記錄的程序。檢測(cè)記錄可有電子版和紙版等方式,其索引清晰,易于查詢,應(yīng)存放在可防止損壞、變質(zhì)、丟失的設(shè)施中。所有記錄應(yīng)安全保護(hù)并采取保密措施,應(yīng)規(guī)定記錄的保存期限。記錄應(yīng)在授權(quán)后才允許公布。
  1. 2電子記錄的管理

     

  2. 2.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有計(jì)算機(jī)系統(tǒng),包含適用的軟件和硬件,用于記錄所有樣本的檢測(cè)信息。檢測(cè)信息包括檢測(cè)申請(qǐng)、檢測(cè)樣本的少有標(biāo)識(shí)、樣本來(lái)源、接收日期和時(shí)間、檢測(cè)數(shù)據(jù)、結(jié)果、檢測(cè)方法、檢測(cè)操作人員等。

     

  3. 2.2實(shí)驗(yàn)室的電子記錄應(yīng)備份,但不能儲(chǔ)存在同一計(jì)算機(jī)或光盤上,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有訪問(wèn)保護(hù)措施,防止未經(jīng)授權(quán)的侵入或修改。

     

  4. 2.3實(shí)驗(yàn)室計(jì)算機(jī)系統(tǒng)只能限于授權(quán)人使用,以高效數(shù)據(jù)的完整性、安全性和高效性。

     

  5. 2.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有電子記錄備份的操作程序,在意外事件發(fā)生后可啟動(dòng)電子數(shù)據(jù)恢復(fù)。

     

  6. 2.5記錄中出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí),不可直接刪除,應(yīng)在相應(yīng)的位置寫出正確值,以避免原始數(shù)據(jù)的丟失或改動(dòng),對(duì)記錄的所有改動(dòng)應(yīng)備注改動(dòng)人的簽名或簽名縮寫及日期。

     

  7. 2.6實(shí)驗(yàn)室電子記錄應(yīng)保存 5年以上。

     

  8. 3紙版記錄的管理

     

  9. 3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按規(guī)定時(shí)限保存紙版記錄。

     

  10. 3.2紙版記錄內(nèi)容可包含檢測(cè)操作步驟、檢測(cè)樣本來(lái)源、少有標(biāo)識(shí)、檢測(cè)人員、檢測(cè)結(jié)果、檢測(cè)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)室主管簽字等。

     

  11. 3.3記錄中出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)不可擦涂,應(yīng)在相應(yīng)的位置寫出正確值,以避免原始數(shù)據(jù)的丟失或改動(dòng),對(duì)記錄的所有改動(dòng)應(yīng)備注改動(dòng)人的簽名或簽名縮寫及日期。

     

    1. 3.4紙版記錄應(yīng)保存 5年以上。

       

    2. 11問(wèn)題和糾正措施
  12. 1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立管理體系和程序文件,明確相應(yīng)的責(zé)任,處理并記錄來(lái)自客戶和其他方面的投訴及問(wèn)題,所有投訴均應(yīng)進(jìn)行調(diào)查并采取糾正措施。實(shí)驗(yàn)室管理體系或技術(shù)操作中的問(wèn)題,可以通過(guò)內(nèi)部或外部的審核、管理評(píng)審、客戶的反饋等途徑進(jìn)行解決。

     

    1. 2當(dāng)檢測(cè)體系未能滿足實(shí)驗(yàn)室規(guī)定的性能指標(biāo)時(shí),應(yīng)記錄所有采取的糾正措施:

       

      1. a)儀器或方法處于操作參數(shù)或性能指標(biāo)以外;

         

      2. b)檢測(cè)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)體系可報(bào)告結(jié)果范圍之外;

         

      3. c)實(shí)驗(yàn)室確定的檢測(cè)程序的參考值(正常值)對(duì)檢測(cè)對(duì)象人群不適用;

         

      4. d)質(zhì)控品和對(duì)照品的結(jié)果不符合實(shí)驗(yàn)室的可接受標(biāo)準(zhǔn);

         

      5. e)試劑、樣本的保存不符合規(guī)定。

         

  13. 3糾正措施應(yīng)便于獲得和執(zhí)行,以確保檢測(cè)結(jié)果和報(bào)告的正確可信。

     

  14. 4應(yīng)記錄、調(diào)查、糾正在患者樣本或 PT/EQA檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的任何問(wèn)題,以防再次發(fā)生。

     

  15. 5應(yīng)記錄、調(diào)查、糾正任何由實(shí)驗(yàn)室空間、人員安全條件不適所致的意外事件,以防再次發(fā)生。

     

  16. 6糾正措施應(yīng)從調(diào)查問(wèn)題的根本原因開(kāi)始,原因分析是糾正措施的關(guān)鍵,應(yīng)仔細(xì)分析問(wèn)題發(fā)生的所有潛在原因,包括但不限于:客戶要求、樣品類型、樣品規(guī)格、檢測(cè)方法和程序、人員的技能和培訓(xùn)、耗材、設(shè)備及其校準(zhǔn)等。

     

  17. 7實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)糾正措施的結(jié)果進(jìn)行監(jiān)控,確認(rèn)檢測(cè)體系能夠恢復(fù)到正常工作狀態(tài),以確定所采取的糾正措施有效。

     

  18. 8對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)體系出現(xiàn)的任何問(wèn)題,糾正措施被確認(rèn)有效前,不應(yīng)對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)或發(fā)放報(bào)告,以避免錯(cuò)誤的發(fā)生。

     

  19. 9所有發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題、原因、解決方法、糾正措施和糾正后的結(jié)果均應(yīng)記錄并存檔。

     

  20. 10當(dāng)檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏離或?qū)?shí)驗(yàn)室的管理制度和程序產(chǎn)生懷疑時(shí),實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡快對(duì)相應(yīng)程序進(jìn)行審核。審核常在糾正措施實(shí)施后進(jìn)行,以確定糾正措施的有效性。

     

  21. 11檢測(cè)體系出現(xiàn)錯(cuò)誤的潛在原因和所需改進(jìn)之處均應(yīng)記錄,無(wú)論是技術(shù)方面還是管理體系方面,均應(yīng)制定預(yù)防措施以減少類似錯(cuò)誤的發(fā)生。

     

A

A

錄 A (規(guī)范性) 擦拭檢測(cè)污染的監(jiān)測(cè)體系

A.1擦拭檢測(cè)的主要試劑和材料
a) 引物;
b) 擦拭檢測(cè)
PCR反應(yīng)液;
c) 瓊脂糖凝膠;
d) 陽(yáng)性對(duì)照:基因組 DNA或稀釋的 PCR產(chǎn)物。如使用 PCR產(chǎn)物,將預(yù)先擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物梯度稀釋(1:1000到 1:1,000,000),檢測(cè)靈敏度須至少達(dá)到 1:10,000。選擇強(qiáng)陽(yáng)性條帶的賊高稀釋度作為擦拭檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照品;
e) 其他:濾紙或者棉簽、鑷子、純水、異丙醇。
A.2擦拭檢測(cè)步驟
A.2.1檢測(cè)點(diǎn)的確定
DNA提取純化區(qū)、PCR試劑配制區(qū)、潔凈區(qū)實(shí)驗(yàn)臺(tái)、潔凈區(qū)地面及常用設(shè)備,均應(yīng)進(jìn)行擦拭檢測(cè)。
A.2.2擦拭步驟
a) 鑷子用異丙醇去污,并用超純水清洗,或者使用一次性無(wú)菌棉簽;
b) 用鑷子將直徑為
1.5cm的濾紙片在純水中浸濕,擦拭 10 cm 2的區(qū)域;
c) 將濾紙或棉簽放入 1.5mL離心管中,加 120 μL超純水,漩渦振蕩;
d) 56℃孵育
1 h,7000r/min離心 30s,4℃保存至使用。
A.2.3擦拭檢測(cè) PCR步驟
a) 將擦拭檢測(cè)
PCR反應(yīng)液加入 PCR管中,同樣將擦拭檢測(cè) PCR反應(yīng)液加入到在工作區(qū)開(kāi)蓋至少一天的 PCR管中(作為空氣中氣溶膠污染的檢測(cè),即開(kāi)管陰性對(duì)照);
b) 擴(kuò)增反應(yīng)包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(無(wú) DNA)、擦拭區(qū)待檢樣本、擦拭區(qū)摻入樣本的陽(yáng)性對(duì)照、開(kāi)管陰性對(duì)照;
c) 用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序擴(kuò)增擦拭樣本和對(duì)照;
d) PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并記錄結(jié)果;
e) 填寫實(shí)驗(yàn)室污染檢測(cè)結(jié)果記錄表,見(jiàn)表 1。
A.3污染區(qū)處理

表 1實(shí)驗(yàn)室污染檢測(cè)結(jié)果記錄表

擦拭區(qū)域 擦拭區(qū)待檢樣本的 PCR結(jié)果 擦拭區(qū)摻入樣本的 PCR結(jié)果
DNA純化區(qū)    
PCR試劑配制區(qū)    
試劑準(zhǔn)備區(qū)    
潔凈區(qū)地面    
PCR儀    
通風(fēng)櫥 /凝膠準(zhǔn)備區(qū)    
擴(kuò)增后區(qū)實(shí)驗(yàn)臺(tái)    
根據(jù)需要增加其他擦拭區(qū)    
本次檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照是否合格:  
本次檢測(cè)的開(kāi)管陰性對(duì)照是否合格:  
本次檢測(cè)是否認(rèn)為擦拭區(qū)無(wú)污染:  

應(yīng)首先用1 mol/L HCl或者10%漂白劑清洗污染區(qū),然后用潔凈水有效清洗干凈。在繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)前,應(yīng)重復(fù)進(jìn)行擦拭檢測(cè)且結(jié)果為陰性(除了擴(kuò)增后區(qū)域),污染區(qū)處理后的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)記錄在案(見(jiàn)表2)。

表 2污染區(qū)處理后的檢測(cè)結(jié)果記錄表

污染區(qū) 清理日期 重檢結(jié)
     
     
     
A.4結(jié)果判
a) 在陽(yáng)性對(duì)照管中應(yīng)有 PCR產(chǎn)物出現(xiàn),陰性對(duì)照管中應(yīng)無(wú) PCR產(chǎn)物出現(xiàn);
b) 每個(gè)擦拭檢測(cè)區(qū)域設(shè)置的“摻入樣本對(duì)照”均應(yīng)出現(xiàn) PCR產(chǎn)物,若該管無(wú) PCR產(chǎn)物則提示 PCR反應(yīng)可能被樣本中的某些物質(zhì)所抑制,對(duì)應(yīng)的“非摻入樣本管”的結(jié)果無(wú)效;
c) 若“非摻入樣本管”中有 PCR產(chǎn)物出現(xiàn),說(shuō)明存在基因組 DNA或 PCR產(chǎn)物的污染,應(yīng)立即啟動(dòng)去污染措施,并重復(fù)進(jìn)行擦拭檢測(cè)以確認(rèn)污染去除成功;
d) 每次檢測(cè)均應(yīng)包括陽(yáng)性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照可以是基因組 DNA或稀釋的 PCR產(chǎn)物,用以檢測(cè)引物是否有效;
e) 每次檢測(cè)均應(yīng)包括陰性對(duì)照和/或開(kāi)管陰性對(duì)照。陰性對(duì)照內(nèi)不含已知來(lái)源的 DNA,用以檢測(cè)試劑污染和/或氣溶膠污染(開(kāi)管陰性對(duì)照)。

參考文獻(xiàn)

 

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[3] ASHI. Standards for Accredited Laboratories, Approved by CMS. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, 2019[4]《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》ISO/IEC 17025: 2017[5]《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力承認(rèn)準(zhǔn)則》ISO 15189: 2012, IDT[6]《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào))[7]《中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例》(中華人民共和國(guó)主管部門令〔2019〕第 717號(hào))


 
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