【佳學(xué)基因檢測】基因檢測家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變及FZD4突變的致病性分析

摘要：

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（Familial Exudative Vitreoretinopathy，簡稱FEVR）是一種遺傳性眼部疾病，通常以視網(wǎng)膜血管發(fā)育異常為特征，并可能導(dǎo)致兒童失明。FEVR的病理特征包括視網(wǎng)膜血管發(fā)育延遲、病理性新生血管、出血、纖維血管增生以及視網(wǎng)膜脫離。隨著基因組學(xué)研究的深入，越來越多的與FEVR相關(guān)的基因突變被發(fā)現(xiàn)，其中FZD4基因的錯義突變在該疾病的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。本研究的目的是通過分析FZD4基因的新突變以及已報道的34個FZD4錯義突變，探討其致病機制并進一步擴展FZD4突變譜。

關(guān)鍵詞：家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變，F(xiàn)ZD4基因，錯義突變，Norrin/β-catenin信號通路，基因檢測

1. 引言

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）是一種以視網(wǎng)膜血管發(fā)育異常為特征的遺傳性眼病。自1969年首次由Criswick和Schepens描述以來，F(xiàn)EVR的研究逐漸深入。該病的主要臨床表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管發(fā)育延遲，導(dǎo)致周邊視網(wǎng)膜出現(xiàn)無血管區(qū)、病理性新生血管、出血和纖維血管增生，嚴(yán)重時可能發(fā)生視網(wǎng)膜脫離，并導(dǎo)致失明。FEVR的病因復(fù)雜，目前已知與該病相關(guān)的基因超過17個，其中與Norrin/β-catenin信號通路相關(guān)的FZD4、NDP、LRP5等基因突變在FEVR患者中占據(jù)主導(dǎo)地位。

FZD4基因位于染色體11q14-q21，編碼一種537個氨基酸的蛋白質(zhì)FZD4。作為Frizzled家族的成員，F(xiàn)ZD4在Wnt信號通路的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。通過研究FZD4基因的突變，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)其突變不僅影響Norrin/β-catenin信號通路的正常功能，還通過改變FZD4蛋白的功能結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管發(fā)育的異常。

本文通過對5例新發(fā)現(xiàn)的FZD4突變的分析，結(jié)合已報道的34種FZD4錯義突變，探討這些突變對FZD4蛋白功能的影響，進一步闡明FZD4突變在FEVR發(fā)病機制中的作用。

2. 研究方法

2.1 臨床樣本的收集與分析

本研究選取了5名診斷為FEVR的先證者及其家族成員。這些患者均接受了眼部檢查，符合FEVR的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有參與者均簽署了知情同意書，并進行了靶向基因組測序。

2.2 FZD4基因突變的檢測與篩選

使用高通量基因組測序技術(shù)對患者的FZD4基因進行靶向檢測，篩選出5個新發(fā)現(xiàn)的錯義突變。對比已知的96種FZD4錯義突變，結(jié)合功能研究，篩選出對FZD4蛋白功能有顯著影響的34個錯義突變，進行致病機制分析。

2.3 突變功能的分析

根據(jù)突變位置及類型，我們構(gòu)建了包括5個新突變在內(nèi)的多種突變質(zhì)粒。這些質(zhì)粒包含29個已報道的FZD4錯義突變和5個新發(fā)現(xiàn)的突變，并用于轉(zhuǎn)染HEK293T、HEK293STF和HeLa細(xì)胞系。通過Western blot、免疫熒光染色、免疫共沉淀等方法檢測不同突變對FZD4蛋白表達、Norrin/β-catenin信號通路激活、膜定位、Norrin結(jié)合能力和DVL2招募能力的影響。

2.4 數(shù)據(jù)分析與分類

根據(jù)FZD4蛋白結(jié)構(gòu)域的不同，我們將這些突變分為五類：信號肽突變、影響二硫鍵的半胱氨酸突變、影響Norrin結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域突變、影響膜定位的跨膜域突變以及影響DVL2招募的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域突變。

3. 結(jié)果

3.1 新發(fā)現(xiàn)的FZD4突變

本研究發(fā)現(xiàn)的5個新突變分別為：S91F、V103E、C145S、E160K、C377F。所有這些突變均位于FZD4蛋白的不同結(jié)構(gòu)域。通過對這些突變進行功能分析，發(fā)現(xiàn)它們均對Norrin/β-catenin信號通路的激活造成了顯著損害。進一步的實驗結(jié)果表明，這些突變影響了FZD4蛋白的正常功能，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管的發(fā)育異常，從而引發(fā)FEVR。

3.2 FZD4錯義突變的致病機制

對比已有文獻中報道的34個FZD4錯義突變，我們對這些突變進行了分類分析。根據(jù)突變的功能變化，我們將其分為以下五類：

1. 信號肽突變：這些突變位于FZD4蛋白的N端信號肽區(qū)域，通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運或分泌受損，從而無法正常表達。

2. 半胱氨酸突變：FZD4蛋白含有多個半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸參與二硫鍵的形成，維持蛋白的三維結(jié)構(gòu)。半胱氨酸突變常導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊不正確或穩(wěn)定性降低，影響其功能。

3. 胞外結(jié)構(gòu)域突變：FZD4的胞外結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)與Norrin蛋白的結(jié)合。突變常導(dǎo)致Norrin的結(jié)合能力下降，從而影響Norrin/β-catenin信號通路的激活。

4. 跨膜域突變：FZD4的七個跨膜結(jié)構(gòu)域是其關(guān)鍵的功能區(qū)域，負(fù)責(zé)蛋白在細(xì)胞膜上的定位及信號的傳遞。跨膜域突變可能導(dǎo)致FZD4的膜定位不穩(wěn)定，進而影響其功能。

5. 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域突變：胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)ZD4招募DVL2等蛋白至細(xì)胞膜至關(guān)重要。突變常導(dǎo)致DVL2的招募能力下降，進而破壞信號傳導(dǎo)。

通過實驗，我們進一步驗證了這些突變類型在FZD4蛋白功能中的具體作用。大多數(shù)突變均導(dǎo)致Norrin/β-catenin信號通路的失活，從而影響視網(wǎng)膜血管的發(fā)育，最終引發(fā)FEVR。

4. 討論

FEVR的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種基因突變，特別是FZD4基因的突變在其中占據(jù)重要地位。FZD4作為Frizzled家族成員，在調(diào)控Wnt信號通路中發(fā)揮著核心作用，尤其是通過Norrin/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血管的發(fā)育。本研究通過對5個新發(fā)現(xiàn)的FZD4突變的功能分析，進一步闡明了這些突變在FEVR中的致病機制。

通過對FZD4錯義突變的分類，我們發(fā)現(xiàn)不同突變對蛋白功能的影響各異。有些突變影響蛋白的合成與分泌，有些則破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。這些突變的共同特點是它們都干擾了FZD4在視網(wǎng)膜發(fā)育中的正常作用，從而導(dǎo)致FEVR的發(fā)生。

與之前的研究結(jié)果相似，我們發(fā)現(xiàn)FZD4的錯義突變主要通過影響Norrin/β-catenin信號通路的激活來導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管發(fā)育的異常。這一發(fā)現(xiàn)為我們理解FEVR的遺傳基礎(chǔ)提供了新的視角，也為后續(xù)的基因診斷和治療策略的制定提供了理論依據(jù)。

5. 結(jié)論

本研究通過對家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）患者中FZD4基因的新突變和已報道的34個錯義突變的分析，進一步擴展了FZD4突變譜，并深入探討了FZD4突變在Norrin/β-catenin信號通路中的致病機制。通過功能實驗，我們證明了FZD4錯義突變可根據(jù)不同的功能變化分為五類，這為臨床上FZD4相關(guān)的FEVR診斷提供了重要的參考。同時，本研究也為將來FEVR的個體化治療提供了新的思路。