【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)透明細(xì)胞腎腫瘤中 von Hippel-Lindau 基因改變方法的改進(jìn)

泌尿科基因檢測(cè)與正確治療導(dǎo)讀：

目的

提供對(duì)透明細(xì)胞腎癌 (ccRCC) 獨(dú)有的癌癥基因組中von Hippel-Lindau VHL基因的體細(xì)胞突變和啟動(dòng)子高甲基化的全面、透徹分析。確定VHL基因改變的流行率和改變亞型與患者和腫瘤特征之間的關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

作為在中國進(jìn)行的一項(xiàng)大型腎癌病例對(duì)照研究的一部分，腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)利用敏感的高通量方法（核酸內(nèi)切酶掃描和 Sanger 測(cè)序）的組合，分析了 205 名特征明確、組織學(xué)證實(shí)的患者腫瘤活檢組織中的VHL突變和啟動(dòng)子甲基化。 )，并分析VHL啟動(dòng)子中的 11CpG 位點(diǎn)。

結(jié)果

腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)在 82.4% 的病例中發(fā)現(xiàn)了突變，這是迄今為止報(bào)道的最高的 VHL 基因突變流行率。對(duì) 11 個(gè)VHL啟動(dòng)子 CpG 位點(diǎn)的分析顯示，8.3% 的腫瘤是高甲基化的，并且都是突變陰性的。總共有 91% 的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌通過遺傳或表觀遺傳機(jī)制表現(xiàn)出基因改變。對(duì)患者和腫瘤特征的分析表明，某些突變亞型與 Fuhrman 核分級(jí)、轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)陽性和自我報(bào)告的腎癌家族史顯著相關(guān)。

結(jié)論

使用這些正確、敏感和實(shí)用的方法檢測(cè)VHL基因改變提供了證據(jù)，證明絕大多數(shù)組織學(xué)證實(shí)的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌腫瘤具有VHL基因的遺傳或表觀遺傳改變，并支持VHL改變是透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌癌變的早期事件的假設(shè)。這些發(fā)現(xiàn)還表明，VHL分子亞型可以在組織學(xué)相似的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌病例中為病因?qū)W、預(yù)后和轉(zhuǎn)化研究提供腫瘤異質(zhì)性的敏感標(biāo)志物。

泌尿科基因檢測(cè)與正確治療介紹

在了解腎癌的遺傳基礎(chǔ)方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。通過使用遺傳連鎖分析和定位克隆對(duì)家族進(jìn)行嚴(yán)格分析，已確定與幾種形式的遺傳性腎細(xì)胞癌 (RCC) 相關(guān)的易感基因。RCC 最常見的亞型是常規(guī)透明細(xì)胞型 (ccRCC)，約占病例的 75%。在家族性和散發(fā)性透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中，VHL基因的等位基因失活已顯示在大多數(shù)分析的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中通過突變、甲基化和/或染色體丟失發(fā)生。

檢查來自透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌散發(fā)病例的腫瘤 DNA 的分子研究提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明VHL改變是致癌過程中常見的早期事件。此外，特定類型的VHL突變可能與病因、疾病進(jìn)展和預(yù)后有關(guān) 。然而，幾項(xiàng)研究已經(jīng)檢查了多個(gè)患者群體中的VHL改變，并報(bào)告了觀察到的突變發(fā)生率的顯著差異，范圍為 50-71%。突變流行率的差異可能是由幾個(gè)因素造成的，包括：i) 檢查的患者群體，ii) 腫瘤組織病理學(xué)，iii) 樣本中腫瘤與正常 DNA 的比率，或 iv) 采用的突變檢測(cè)方法。例如，在分子研究中納入非透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌腫瘤預(yù)計(jì)會(huì)降低觀察到的VHL突變患病率，因?yàn)閂HL突變?cè)谄渌愋偷哪I癌中很少見。

必須使用正確、靈敏和實(shí)用的高通量突變檢測(cè)方法來分析大量特征明確的樣本，以便將VHL突變的患病率、類型和位置與病因或預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)聯(lián)。以前的研究依賴于掃描技術(shù)，例如變性高效液相色譜或單鏈構(gòu)象多態(tài)性，然后使用 Sanger 測(cè)序?qū)ψ凅w進(jìn)行注釋。這些掃描技術(shù)都不能達(dá)到與毛細(xì)管電泳平臺(tái)上熒光 Sanger 測(cè)序數(shù)據(jù)生成相匹配的吞吐量水平。

最近，已經(jīng)開發(fā)出一種新的掃描技術(shù)，它比以前的方法具有關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，尤其是與 Sanger 測(cè)序結(jié)合使用時(shí)。核酸內(nèi)切酶掃描利用從芹菜中純化的酶（Cel I 和 II）來檢測(cè)擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物中的突變。核酸內(nèi)切酶在錯(cuò)配位點(diǎn)切割異源雙鏈 DNA，消化物按其大小分開。切割產(chǎn)物及其大小不僅表明變異的存在，而且還提供其位置信息，從而在對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序時(shí)可以快速輕松地識(shí)別突變。當(dāng)前研究的主要目的是應(yīng)用這種新的突變檢測(cè)方法來分析VHL作為腎癌病因和生存的大型國際分子流行病學(xué)研究的一部分收集的一組腫瘤樣本中的基因突變，選擇代表組織病理學(xué)變量和已知腎癌風(fēng)險(xiǎn)因素的分布。第二個(gè)目標(biāo)是提供全面的遺傳和表觀遺傳分析，以闡明體細(xì)胞突變與VHL啟動(dòng)子高甲基化之間的關(guān)系ccRCC特有的癌癥基因組中的基因。這一目標(biāo)將通過僅使用從冷凍組織切片中提取的 DNA 來實(shí)現(xiàn)，這些切片是由 NCI 腎腫瘤病理學(xué) (MM) 專家通過組織學(xué)證實(shí)的透明細(xì)胞病例 (ccRCC) 使用分析組合有效搜索和確認(rèn)所有突變來實(shí)現(xiàn)的。方法實(shí)用、靈敏但適用于大量病例分析.

泌尿科基因檢測(cè)與正確治療材料和方法

腫瘤DNA

從在中國和東歐進(jìn)行的腎癌大型病例對(duì)照研究中納入的病例中的一部分患者腫瘤樣本（N=205）被選中，以包括按腫瘤分期、等級(jí)和已知風(fēng)險(xiǎn)因素（如性別、體重指數(shù)（BMI）、高血壓、吸煙。腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)根據(jù)國家癌癥研究所、國際癌癥研究機(jī)構(gòu)和當(dāng)?shù)貦C(jī)構(gòu)審查委員會(huì)獲得了潛在參與者的知情同意。在病理檢查后進(jìn)行腫瘤 DNA 提取，并進(jìn)行手動(dòng)宏觀解剖以去除非腫瘤組織。似乎包含至少 70% 腫瘤細(xì)胞的樣本區(qū)域用于 DNA 提取。對(duì)于每個(gè)樣品，5 mm 3將組織切片并在 50°C 下用每 μl 消化緩沖液（500 mM KCl、100 mM Tris-HCl、15 mM MgCl 2、0.5% Tween 20）用 0.4 μg 蛋白酶 K 消化。使用標(biāo)準(zhǔn)方案1從消化的樣品中提取 DNA。使用 ND-1000 分光光度計(jì) (Nanodrop, Wilmington, DE) 對(duì) DNA 進(jìn)行定量。

聚合酶鏈反應(yīng)

使用 10-15 ng 腫瘤 DNA 和 1.25 U HotMaster Taq DNA 聚合酶（Eppendorf，Westbury，NY）或 Hot-Start Taq DNA 聚合酶（Denville Scientific，Metuchen，NJ）在 50 μl 反應(yīng)中擴(kuò)增患者腫瘤 DNA使用各自的 1x 反應(yīng)緩沖液和 0.2 mM 的每種 dNTP，以及 0.2 μM 的正向和反向引物。使用 MJ Research (Bio-Rad, Waltham, MA) Dyad 和 Tetrad DNA 引擎以及 95°C 2 分鐘、10 個(gè)著陸 PCR 循環(huán)、然后 30 個(gè) 95°C 30 秒循環(huán)的程序完成熱循環(huán)， 58°C 30 秒，68°C 30 秒；然后在 68°C 下進(jìn)行最后 5 分鐘的延伸。PCR 產(chǎn)物使用 95°C 的程序進(jìn)行異源雙鏈化 5 分鐘，以 -2.0°C/秒冷卻至 85°C，以 -0.2°C/秒冷卻至 25°C，然后在 4°C 下孵育熱循環(huán)儀。

核酸內(nèi)切酶掃描

將異源雙鏈 PCR 樣品與 15 U 的 Surveyor Nuclease W 和 1 μl Surveyor Enhancer W（Transgenomic，Omaha，NE）結(jié)合，并在 42°C 下孵育 20 分鐘。通過添加 2 μl 終止溶液（0.5 M EDTA，pH 8.0）終止消化，并在配備有高靈敏度檢測(cè)系統(tǒng)和 DNASep® HT 柱（Transgenomic）的 WAVE® HPLC 儀器上進(jìn)行分析。運(yùn)行參數(shù)是在 50°C 烘箱溫度下使用雙鏈大小的多片段應(yīng)用的 12 μl 注射體積。補(bǔ)充方法中描述了 WAVE HPLC 梯度參數(shù). 紫外檢測(cè)為 260 nm，熒光檢測(cè)為 495 nm 激發(fā)/537 nm 發(fā)射。運(yùn)行 100 bp DNA 梯（New England Biolabs，Ipswich，MA）作為大小標(biāo)記。使用 WAVE Navigator 軟件進(jìn)行儀器控制、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。每個(gè) PCR 產(chǎn)物板都包括陽性和陰性對(duì)照，以監(jiān)測(cè)核酸內(nèi)切酶切割效率。

VHL基因測(cè)序

使用 Ampure PCR Purification system (Agencourt Bioscience, Beverly, MA) 從 10 μl PCR 產(chǎn)物中去除多余的 PCR 引物。純化產(chǎn)物在 30 μl 去離子水中洗脫。使用 BigDye v. 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 的反應(yīng)化學(xué)和循環(huán)測(cè)序改編自制造商的建議。使用 CleanSeq 試劑 (Agencourt Bioscience Corp., Beverly, MA) 純化循環(huán)測(cè)序產(chǎn)物。純化的測(cè)序產(chǎn)物在 40 μl 0.01 μM EDTA 中洗脫，30 μl 在 ABI 3100 遺傳分析儀上運(yùn)行。通過增刊中描述的幾種方法分析序列色譜圖。方法。

VHL啟動(dòng)子甲基化

使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì) 100-500 ng 腫瘤 DNA 進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾（Zymo Research Labs，Orange，CA）。引物（補(bǔ)充方法）) 旨在擴(kuò)增 VHL 啟動(dòng)子的 11 個(gè) CpG 二核苷酸的甲基化和未甲基化等位基因。在 MJ Research PTC200 熱循環(huán)儀中對(duì) 2 μl 處理過的 DNA 進(jìn)行 PCR：在 95°C 下變性 5 分鐘，在 50°C 退火溫度下進(jìn)行 10 個(gè)循環(huán)，然后在 95°C 下進(jìn)行 35 個(gè) 30 秒循環(huán)，30 秒在 50°C 下，在 72°C 下 60 秒，然后在 72°C 下最后延伸 5 分鐘。使用上述循環(huán)條件對(duì) 1 μl 1:10 稀釋的第一輪產(chǎn)物進(jìn)行巢式 PCR。PCR 產(chǎn)物 (5 μl) 在 2.0% 瓊脂糖中可視化并進(jìn)行雙向測(cè)序。在色譜圖中檢查 CpG 中的胞嘧啶位置的胸腺嘧啶或胞嘧啶信號(hào)如下：僅 T，未甲基化；胞嘧啶和胸腺嘧啶，部分甲基化；僅 C，有效甲基化。包含至少 4 個(gè)分析的甲基化 CpG (>36%) 的腫瘤樣本被認(rèn)為是甲基化的。所有分析均一式兩份進(jìn)行，不知道VHL突變狀態(tài)，陽性（CpGenome Universal Methylated DNA, Chemicon/Millipore, Billerica, MA）和陰性（K562 Human Genomic DNA, Promega, Madison, WI）對(duì)照。

亞克隆

PCR 產(chǎn)物的克隆利用拓?fù)洚悩?gòu)酶激活的載體和 TOPO 克隆試劑盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。通過菌落 PCR 制備擴(kuò)增的插入片段，并在量化含有突變等位基因的克隆數(shù)量之前如上所述進(jìn)行測(cè)序。

統(tǒng)計(jì)分析

VHL突變和啟動(dòng)子甲基化被認(rèn)為是每個(gè)病例的二分變量（否/是）。腫瘤和受試者特征，例如臨床分期、等級(jí)、淋巴結(jié)分期（N0、N1、N2）、體重指數(shù)（BMI）（<25、25-35、35+）、吸煙包年數(shù)（0、1-20 , 20+) 和吸煙狀況 (從不, 以前, 當(dāng)前), 被認(rèn)為是分類變量。其他變量，如轉(zhuǎn)移（M0，M1）自我報(bào)告的高血壓（無/是），癌癥家族史（無/是-腎臟和無/是-任何），性別和診斷時(shí)的年齡（<50，≥50年）被認(rèn)為是二分變量。VHL的患病率變更的計(jì)算方法是將發(fā)生變更的病例數(shù)除以分析的病例總數(shù)。缺少信息的病例被排除在分析之外?？ǚ綑z驗(yàn)應(yīng)用于列聯(lián)表（2×2）分析，以檢驗(yàn)每組有無改變的病例數(shù)之間的差異。有序邏輯回歸用于分析分類變量與具有特定VHL改變的病例之間的關(guān)聯(lián)。所有分析均使用 STATA 9.0（Stata Corporation，College Station，TX）進(jìn)行，所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試都是雙向的。

泌尿科基因檢測(cè)與正確治療結(jié)果

試驗(yàn)研究

從 22 個(gè)腎癌患者腫瘤中提取的 DNA 具有先前特征的VHL基因突變，用于比較內(nèi)切酶掃描相對(duì)于 DHPLC 的特異性和敏感性。使用這兩種技術(shù)檢測(cè)所有突變。為了評(píng)估核酸內(nèi)切酶掃描的敏感性，將來自六個(gè)具有已知突變的腫瘤 DNA 樣品的 PCR 產(chǎn)物的系列稀釋液與正常擴(kuò)增子組合并進(jìn)行分析。這兩種技術(shù)都成功地檢測(cè)到了含有 3-5% 突變/正常 DNA 的 DNA 稀釋液中的突變（數(shù)據(jù)未顯示）。

患者和腫瘤特征

病例的選擇包括性別分布、診斷年齡、組織病理學(xué)參數(shù)（如腫瘤分期和分級(jí)）以及該人群中普遍存在的其他腎癌風(fēng)險(xiǎn)因素，如高血壓、高 BMI、吸煙和家族史癌癥。表格1提供了本研究中包括的病例的患者和腫瘤特征的頻率分布。大多數(shù)病例（63%）來自捷克共和國。在整個(gè)研究人群中，性別、吸煙習(xí)慣、BMI 類別和高血壓患病率相似。

表格1:本研究病例中患者和腫瘤特征的分布

	ñ	%
總病例	205	100%
中心
羅馬尼亞	36	18%
波蘭	21	10%
俄羅斯	19	9%
捷克共和國*	129	63%
性別
男性	122	60%
女性	83	40%
吸煙狀況
絕不	89	45%
曾經(jīng)	110	55%
體重指數(shù)†
<25	54	26%
25-35	147	72%
>35	4	2%
自我報(bào)告的高血壓
不	108	53%
是的	97	47%
腫瘤階段
T	42	20%
T2	92	45%
T3/T4	54	26%
失蹤	17	8%
轉(zhuǎn)移
MX	37	18%
M0	148	72%
M1	9	4%
失蹤	11	5%
福爾曼核級(jí)
我	2	1%
二	154	75%
三	39	19%
四	3	1%
失蹤	7	3%

*捷克中心包括布爾諾、奧洛穆茨、布拉格、捷克布杰約維采

†采訪時(shí)的體重指數(shù) (BMI)

VHL突變分析

所有突變和 SNP 的詳細(xì)注釋可以在補(bǔ)充表 1中找到。內(nèi)切酶消化分析的代表性結(jié)果顯示在補(bǔ)充圖 1 和 2a-f中。使用 Navigator 軟件，通過將消化圖譜與大小階梯疊加來確定內(nèi)切核酸酶切割產(chǎn)物大小。這允許在序列色譜圖中快速定位變體。腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)觀察到使用核酸內(nèi)切酶鑒定的突變與在正向和反向測(cè)序色譜圖中檢測(cè)到的突變之間存在 100% 的一致性。總體而言，VHL在 82.4% (169/205) 的病例中發(fā)生突變（表 2）。在 3.4% (7/205) 的病例中發(fā)現(xiàn)了雙突變。先前描述的 P25L 變體存在于 8 名患者 (4%) 中。與之前的研究一樣，這種變異不被認(rèn)為是突變，然而，其中 6 例 (75%) 還具有另一種VHL改變?？偣?3% (N=7) 的腫瘤表現(xiàn)出編碼 SNP，2% (N=4) 具有 IVS 2+43 內(nèi)含子 SNP。共有 176 個(gè)VHL鑒定出突變，包括缺失（34%，N=59）、插入（24%，n=42）、錯(cuò)義（24%，N=42）、無義（10%，N=18）和剪接點(diǎn)改變（ 9%，N=15)。15 個(gè)剪接點(diǎn)突變中有 10 個(gè)發(fā)生在內(nèi)含子的第一個(gè)堿基中，并且都在外顯子的 3 個(gè)堿基內(nèi)觀察到。外顯子突變的發(fā)生率為：外顯子 1, 37% (N=65); 外顯子 2, 34% (N=59); 和外顯子 3, 30% (N=52)。腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)似乎影響外顯子 2/3 剪接并可能截?cái)嗝艽a子 155 下游的蛋白質(zhì)的改變發(fā)生率很高（6%，N=11）。圖1A顯示VHL基因的改變從密碼子 52（缺失）到 213（插入）分布，不包括 P25L 變體。突變的亞型如先前報(bào)道的那樣分布。

圖1:VHL 突變的密碼子分布。A、所有突變；B，具有低 RSI 值 (5-30%) 的突變。

表 2：在 205 例組織學(xué)證實(shí)的透明細(xì)胞腎腫瘤中觀察到 von Hippel-Lindau (VHL) 基因突變的亞型

病例數(shù)（N = 205）			突變數(shù)（N = 176）
VHL 狀態(tài)	ñ	%	類型	ñ	%	突變位置	ñ	%	RSI *斌	ñ	%	數(shù)據(jù)庫	ñ	%
突變	169	82	刪除	59	34	外顯子 1	62	35	低的	80	45	是的	124	70
1 突變	162	79	插入	42	24	內(nèi)含子 1	4	2	中等的	92	52	不	52	30
2 突變	7	3	錯(cuò)義	42	24	外顯子 2	50	28	高的	4	2
無突變	36	18	無意義	18	10	內(nèi)含子 2	11	6
P25L ‡	8	4	拼接†	15	9	外顯子 3	49	28
沉默子‡	7	3

*突變等位基因與野生型相比的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度 (RSI)

†剪接突變包括內(nèi)含子-外顯子邊界 3 個(gè)堿基內(nèi)的內(nèi)含子核苷酸變化。

‡ P25L 和沉默突變僅供參考，在未來計(jì)算中未歸類為功能性突變。

VHL突變狀態(tài)的確認(rèn)

重復(fù)分析來自一半 VHL 突變病例 (N=20) 和野生型子集 (N=19) 的 20 個(gè)突變陽性病例并以盲法評(píng)分。除了一個(gè)突變外，所有突變都得到確認(rèn)（95% 的一致性，38/39），并且這種假陽性被排除在后續(xù)計(jì)算之外。使用高保真聚合酶（不同于第一輪分析）對(duì)后半部分病例進(jìn)行了重新擴(kuò)增（268/273 個(gè)擴(kuò)增子），并且在所有病例中都確認(rèn)了VHL突變或野生型狀態(tài)。由于 DNA 數(shù)量有限，五個(gè)樣本未能擴(kuò)增且未重復(fù)。

相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度 (RSI)

對(duì)從正向和反向測(cè)序色譜圖中平均的突變型和野生型峰高的檢查顯示，從許多腫瘤擴(kuò)增的 DNA 中突變型核苷酸的熒光信號(hào)顯著低于野生型核苷酸峰的熒光信號(hào)。圖 1 B呈現(xiàn)具有低 RSI 的突變分布。為了計(jì)算突變峰高的 RSI，腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)對(duì)來自正向和反向測(cè)序軌跡的峰高的視覺估計(jì)值進(jìn)行平均，除以單個(gè)核苷酸位置處存在的總信號(hào)（突變體 + 野生型峰）。這些 RSI 估計(jì)值分為高 (>60%)、中 (31-60%) 和低 (5-30%) 箱，以估計(jì)可能難以使用測(cè)序軟件分析的突變比例。例如，與總熒光相比，低 RSI bin 中的突變表現(xiàn)出不到 30% 的信號(hào)，而從野生型核苷酸中觀察到的信號(hào)超過 70%。如圖所示表 2, 46% 的變體表現(xiàn)出較低的 RSI 值。這些樣本代表突變信號(hào)很容易被野生型序列掩蓋的情況，尤其是在高背景存在的情況下。商業(yè)上可用的測(cè)序軟件對(duì)低 RSI 突變的自動(dòng)檢測(cè)是不高效的。

通過亞克隆確認(rèn)等位基因頻率

為了確定 RSI 的視覺估計(jì)是否反映了原始腫瘤 DNA 中突變等位基因的比例，或者 PCR 和測(cè)序是否引入了對(duì)野生型的偏倚，來自 10 個(gè)含有 RSI 值在 10-50% 之間的突變的腫瘤的 PCR 產(chǎn)物被擴(kuò)增和亞克隆(表3）。每個(gè)腫瘤平均有 48 個(gè)亞克隆計(jì)數(shù)突變和野生型等位基因，每個(gè)亞克隆都在兩條鏈上進(jìn)行測(cè)序。通常，通過亞克隆確定的突變等位基因頻率同意在視覺 RSI 估計(jì)值的 ± 12% 范圍內(nèi)（7/10 例）。五個(gè)具有缺失的腫瘤各自具有低于從亞克隆確定的突變等位基因頻率的 RSI 值。這可能表明，對(duì)于缺失的 RSI 的視覺估計(jì)是不正確的，或者，與序列色譜圖中的野生型等位基因相比，缺失實(shí)際上顯示出較低的熒光信號(hào)。

表3：通過亞克隆和 RSI 估計(jì)的突變等位基因頻率的比較*

				突變等位基因頻率
腫瘤識(shí)別	外顯子	腫瘤 DNA 測(cè)序†	克隆測(cè)序	相對(duì)強(qiáng)弱指數(shù) (%) *	克隆‡	(%)
4_1	3	763刪除	763 delCTCTACG	20	18/56	32
4_6	2	613 G>T	613 G>T	40	17/48	35
4_8	2	652 A>G	652 A>G	50	21/38	55
4_12	1	469 C>T	469 C>T	40	9/31	29
4_16	2	581刪除	581刪除	30	21/58	36
4_31	3	IVS2−1 G>A	IVS2−1 G>A	25	3/40	8
4_47	3	752 刪除	752 delTCGTCA	30	18/54	33
4_53	2	574 插入	574 delGA	10	20/57	35
4_65	2	570 刪除	570 delCAGAGAT	20	24/55	44
4_70	2	665 T>C	665 T>C	30	21/50	42

*突變等位基因的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度 (RSI) 與總熒光比較

†插入和缺失未在腫瘤 DNA 測(cè)序中表征

‡陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量

VHL啟動(dòng)子甲基化

基因失活的另一種機(jī)制是通過啟動(dòng)子高甲基化。大多數(shù)研究使用甲基化特異性 PCR (MSP)，它依賴于幾個(gè) CpG 的甲基化來確定啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。與 MSP 一樣，腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)分析了亞硫酸氫鹽處理的 DNA，但設(shè)計(jì)的引物可同樣擴(kuò)增甲基化和未甲基化的等位基因。為了提供全面的分析，在亞硫酸氫鹽處理后，腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)使用 Sanger 測(cè)序來評(píng)估 CpG 中的胞嘧啶位置。VHL的 11 個(gè)連續(xù) CpG 中的胞嘧啶（甲基化）：胸腺嘧啶（未甲基化）比率發(fā)起人。選擇突變陰性 (94%, 34/36) 和陽性 (12%, 21/169) 腫瘤進(jìn)行分析。17 例 (8.3%, 17/205) 病例具有至少 4 個(gè)甲基化 CpG，被認(rèn)為是高甲基化并可能沉默。所有甲基化病例的VHL突變均為陰性（圖 2）?？傊?，91% (186/205) 的病例通過突變 (82.4%, N=169) 或高甲基化 (8.3%, N=17)表現(xiàn)出潛在的VHL失活。

圖 2：突變陰性 (N=16) 和突變陽性 (N=10)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌DNA 中 11 個(gè) CpG的VHL啟動(dòng)子甲基化分析。每個(gè) CpG 的甲基化狀態(tài)如下所示：黃色 = 未甲基化，藍(lán)色 = 部分甲基化，紅色 = 有效甲基化，陰影框表示 CpG 沒有提供信息。每個(gè)分析中包含的陽性（甲基化）和陰性（未甲基化）對(duì)照顯示在底部，VHL突變狀態(tài)顯示在左側(cè)。有效和部分甲基化的 CpG 位點(diǎn)在最右邊的列中相加。在 VHL 啟動(dòng)子中具有至少 4 個(gè)甲基化 CpG 位點(diǎn)的病例被認(rèn)為是甲基化陽性。

患者和腫瘤特征的VHL狀態(tài)

VHL改變隨后根據(jù)腫瘤組織病理學(xué)和患者特征進(jìn)行分層，總結(jié)如下：表 4. 突變病例的總體患病率與所檢查的任何腫瘤或患者特征無關(guān)，然而，某些突變亞型的患病率是相關(guān)的。例如，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤 (M1) 的雙突變明顯多于沒有轉(zhuǎn)移的腫瘤 (M0) (22.2% vs. 2.7%; P=0.003)。無義突變與 Fuhrman 核分級(jí)（P=0.03）和淋巴結(jié)陽性（P=0.05）相關(guān)，并且在 M1 病例中比 M0 病例更普遍（P=0.01）。變化的位置似乎也因組而異。例如，外顯子 3 突變?cè)?M1 病例中比 M0 病例更普遍（70.0% 對(duì) 25.2%；P=0.01），在有腎癌家族史的病例中（66.7% 對(duì) 25.2%；P=0.007）。值得注意的是，所有 6 例具有陽性腎癌家族史的病例都具有含有VHL突變和 4/6 突變 (66.7%) 位于外顯子 3。最后，位于外顯子 3 的VHL改變的發(fā)生率從低 BMI (<25) 受試者的 8.3% 增加到高 BMI 受試者的 25.5% ( >35) (趨勢(shì)=0.07)。

表 4：與患者描述和臨床特征相關(guān)的 Von Hippel-Lindau 改變亞型

‡突變總數(shù)

*未添加到 205 的亞組是由于缺少臨床或風(fēng)險(xiǎn)因素信息

†僅用于比較 M0 與 M1 的 p 值

兩組均與無癌癥家族史的病例進(jìn)行比較

∥一級(jí)親屬患有癌癥或腎癌

泌尿科基因檢測(cè)與正確治療討論

在這項(xiàng)研究中，使用核酸內(nèi)切酶掃描和熒光 Sanger 測(cè)序的新組合分析了來自 205 個(gè)組織學(xué)證實(shí)、宏觀解剖的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌腫瘤的 DNA 的VHL基因改變。當(dāng)并行應(yīng)用時(shí)，82.4% (169/205) 的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌病例中檢測(cè)到突變。這是迄今為止報(bào)道的VHL突變的最高流行率，也是在單項(xiàng)研究中分析的組織學(xué)證實(shí)的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌腫瘤數(shù)量最多的一次。對(duì)VHL啟動(dòng)子的詳細(xì)分析確定了另外 8.3% 的高甲基化和可能沉默的腫瘤。值得注意的是，在這項(xiàng)研究中，甲基化和突變是相互排斥的。總共有 91% 的病例表現(xiàn)出VHL的遺傳和表觀遺傳改變基因。對(duì)患者和腫瘤特征的分析表明，突變的總體患病率與通常與疾病進(jìn)展相關(guān)的臨床參數(shù)無關(guān)，但特定的突變亞型與 Fuhrman 核分級(jí)、轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)陽性和腎癌家族史相關(guān)。敏感和正確的突變檢測(cè)方法（例如此處描述的那些方法）將通過最大限度地減少VHL突變/啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)對(duì)病例的錯(cuò)誤分類，并降低偏向無效關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)，將成為未來研究的一個(gè)優(yōu)勢(shì)。

之前檢查過VHL突變和甲基化的一些最大的研究（93-205 例腎癌病例）報(bào)告了較少的VHL基因突變（在 42和 71%)。這些研究利用了單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (SSCP) 和變性高效液相色譜法 (DHPLC) 。正如之前觀察到的，腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)記錄了密碼子 65、114、147 和 155 的高流行率，盡管只有 6% 的突變發(fā)生在密碼子 147/148。突變?cè)谕怙@子中均勻分布，而其他研究報(bào)告外顯子 1 和 2 的頻率更高。最后，本研究中 3.4% (7/205) 的腫瘤顯示出兩種VHL改變，Banks 等人報(bào)告了一個(gè)病例 (1%, 1/93)，而大多數(shù)其他研究沒有報(bào)告。VHL 啟動(dòng)子的高甲基化僅在突變陰性腫瘤中觀察到，觀察到的患病率在先前報(bào)道的范圍內(nèi)（分別為 5% 和 17%）。相比之下，一項(xiàng)較早的研究報(bào)告說，21% 的腫瘤是高甲基化的，其中一半 (11/19, 58%) 具有VHL突變。這種差異可能是由于用于評(píng)估啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的不同方法或檢查的組織學(xué)腎癌亞型之間的差異造成的。在這項(xiàng)研究中，一位專家對(duì)病例進(jìn)行了詳盡的審查，以確保本研究中包括的所有病例都是組織學(xué)證實(shí)的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的高效性。

一旦使用核酸內(nèi)切酶掃描和測(cè)序鑒定出突變，就會(huì)估計(jì) RSI 值以確定使用自動(dòng)序列分析難以或不可能檢測(cè)到的比例。為了避免低 RSI VHL突變體的錯(cuò)誤分類，來自突變病例子集的 PCR 產(chǎn)物被亞克隆以確認(rèn)它們的身份。突變狀態(tài)在 10/10 病例中得到確認(rèn)，在 10 個(gè)腫瘤中的 7 個(gè)中，突變等位基因頻率從突變陽性轉(zhuǎn)化子的百分比計(jì)算得出，與 RSI 視覺估計(jì)一致。

為了降低假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)，在提取 DNA 之前，根據(jù)對(duì)一張 H&E 染色載玻片的病理學(xué)審查，對(duì)所有冷凍腫瘤活檢組織進(jìn)行宏觀解剖以去除正常組織，以獲得每個(gè)樣本至少 70% 的腫瘤組織。出于這個(gè)原因，觀察到的具有低 RSI 值的高百分比變體 (46%) 是出乎意料的。腫瘤通常含有不同數(shù)量的正常組織和細(xì)胞。特別是腎腫瘤可以高度血管化。正常組織或血細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）的腫瘤浸潤可降低樣本中腫瘤與正常 DNA 的比例。萊恩漢等人檢查了七個(gè)沒有任何可見正常組織的腎癌腫瘤。在腎癌組織的酶促分散后，他們觀察到只有 20-50% 是腫瘤細(xì)胞（平均 26 ± 15%）。同樣，Belldegrun 等人檢查了 37 個(gè)腫瘤，發(fā)現(xiàn) 6-75% 的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞（平均值為 39 ± 3%）。有理由認(rèn)為，在這里檢查的大約一半腫瘤中，RSI 估計(jì)的突變等位基因數(shù)量較少，這是因?yàn)槟[瘤與未通過宏觀解剖切除的正常組織的比例較低。與其他類型的腫瘤組織相比，淋巴細(xì)胞浸潤、血管結(jié)構(gòu)和周圍正常組織似乎是腎腫瘤的重要組成部分。患者樣本中腫瘤組織與正常組織的污染也可以解釋報(bào)告中的差異ccRCC 中的VHL突變頻率。腫瘤組織中存在大量正常細(xì)胞強(qiáng)烈要求應(yīng)用高度敏感和正確的突變檢測(cè)方法，例如此處介紹的方法，以確保檢測(cè)到所有突變。這一結(jié)論是基于觀察到腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)用所描述的方法檢測(cè)到的VHL突變頻率超過了所有先前研究中檢測(cè)到的腎癌VHL體細(xì)胞突變頻率。

在腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)完成對(duì)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌癌癥基因組中體細(xì)胞突變和甲基化的綜合分析后，腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)將遺傳發(fā)現(xiàn)與患者的臨床和描述特征相關(guān)聯(lián)。對(duì)患者和腫瘤亞組中突變流行率的分析表明，總突變流行率與任何檢查的參數(shù)無關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與其他研究相似，并支持VHL基因失活可能是ccRCC致癌過程中的早期事件的假設(shè)。與之前的一些研究不同，腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)沒有觀察到高階段腫瘤中 VHL 突變/高甲基化的發(fā)生率更高腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)也沒有觀察到高甲基化或雙突變的患病率差異。腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)確實(shí)發(fā)現(xiàn)晚期轉(zhuǎn)移性病變比 M0 或 Mx 病例具有更多的雙突變、無義突變和位于外顯子 3 的突變。腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)還觀察到，無義突變的流行與分級(jí)和淋巴結(jié)陽性顯著相關(guān)，并且有腎癌家族史的病例在外顯子 3 上的突變明顯更多。生存研究將是確定這些分子亞型是否具有任何預(yù)后意義所必需的。關(guān)聯(lián)。

個(gè)性化醫(yī)療的一個(gè)目標(biāo)是識(shí)別具有特定改變的腫瘤，這些改變可用于預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的臨床反應(yīng)。最近的一項(xiàng)研究表明，具有VHL甲基化或截短突變的轉(zhuǎn)移性腎癌患者在接受抗血管生成治療期間腫瘤進(jìn)展時(shí)間延長。腎臟癌的靶向治療特別行動(dòng)團(tuán)隊(duì)表明，91% 的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌病例可以通過VHL改變亞型分離腫瘤。這些發(fā)現(xiàn)表明，VHL分子亞型可以為病因?qū)W、預(yù)后和轉(zhuǎn)化研究的組織學(xué)相似病例中的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌腫瘤異質(zhì)性提供敏感的生物標(biāo)志物。

Improved identification of von Hippel-Lindau gene alterations in clear cell renal tumors.

Nickerson ML, Jaeger E, Shi Y, Durocher JA, Mahurkar S, Zaridze D, Matveev V, Janout V, Kollarova H, Bencko V, Navratilova M, Szeszenia-Dabrowska N, Mates D, Mukeria A, Holcatova I, Schmidt LS, Toro JR, Karami S, Hung R, Gerard GF, Linehan WM, Merino M, Zbar B, Boffetta P, Brennan P, Rothman N, Chow WH, Waldman FM, Moore LE.

Clin Cancer Res. 2008 Aug 1;14:4726-34. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-4921.

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)

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