佳學(xué)基因病源體基因檢測(cè)項(xiàng)目mNGS對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的革新

1）傳統(tǒng)方法介紹

傳統(tǒng)的病源體檢測(cè)是采用涂片鏡檢的方法，是指將待檢樣品取材、制片后在顯微鏡下觀察、分析和判斷樣品中微生物種類的一種臨床診斷方法，通常用于疾病的初步判斷。人體的排泄物、分泌物或病患組織都可以作為檢查對(duì)象。常見(jiàn)的涂片鏡檢有革蘭氏染色法，可檢出革蘭氏陽(yáng)性菌（如肺炎雙球菌、炭疽桿菌）、陰性菌（如百日咳桿菌、痢疾桿菌）。經(jīng)過(guò)包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等步驟后，革蘭氏陽(yáng)性菌呈現(xiàn)紫色，革蘭氏陰性菌呈現(xiàn)紅色并且由于染色使得細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征更易于觀察，從而更利于分類鑒定。

生化方法是通過(guò)檢測(cè)微生物表達(dá)的特異性的酶，從而鑒定微生物種類的方法。使用特定的底物，檢測(cè)微生物代謝底物的能力，即可判斷微生物是否具有某種特定的酶。例如檢測(cè)沙門氏菌的辛酯酶法。各屬腸桿菌科細(xì)菌中只有沙門氏菌表達(dá)辛酯酶，根據(jù)這一特性，甄宏太等開(kāi)發(fā)了快速檢測(cè)沙門氏菌的辛酯酶法。該方法是以42甲基傘形酮辛酯（MUCAP）為底物，在沙門氏菌的酶促反應(yīng)后，生成4MU，在紫外燈下可觀察到藍(lán)色熒光。該方法在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成，適合病菌的初步篩查。

全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)是一種集生化反應(yīng)、計(jì)算機(jī)和自動(dòng)化技術(shù)于一體的檢測(cè)技術(shù)，具有速度快，通量高的優(yōu)點(diǎn)。常見(jiàn)儀器如法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK系統(tǒng)和美國(guó)BD公司的PHOENIX系統(tǒng)。自動(dòng)化系統(tǒng)可進(jìn)行多達(dá)幾十種的微量生化反應(yīng)和藥敏生長(zhǎng)試驗(yàn)，根據(jù)各生化反應(yīng)孔中的生長(zhǎng)變化及呈色反應(yīng)情況，由計(jì)算機(jī)通過(guò)數(shù)值編碼技術(shù)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析，得到鑒定結(jié)果。

免疫學(xué)檢測(cè)是利用抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定量、定位的檢測(cè)。既可以檢測(cè)病原菌的抗原，也可以檢測(cè)免疫細(xì)胞的抗體?？乖瓩z測(cè)可以確認(rèn)病原菌，而抗體檢測(cè)則是病人健康評(píng)估的方法，兩者相輔相成。通常將待檢測(cè)的抗原（或抗體）結(jié)合蛋白預(yù)先連接上某種標(biāo)記物，借助標(biāo)記物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度，在光鏡或電鏡下進(jìn)行定性、定位或定量研究。比如診斷肺炎時(shí)可通過(guò)肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌尿抗原檢測(cè)及血清隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)診斷醫(yī)院獲得性肺炎。

微生物培養(yǎng)是通過(guò)培養(yǎng)樣品中的微生物再結(jié)合檢測(cè)液體菌液濃度（對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基檢測(cè)菌落數(shù)）、或聯(lián)合生化或免疫學(xué)檢測(cè)對(duì)微生物進(jìn)行鑒定的方法。例如羅氏培養(yǎng)法可以用于診斷肺結(jié)核病。羅氏培養(yǎng)基可促進(jìn)分枝桿菌的生長(zhǎng)并抑制其他雜菌，經(jīng)培養(yǎng)3-4周后分枝桿菌形成菌落，呈干燥顆粒狀，乳白色或米黃色，形似花菜心。

2）mNGS與傳統(tǒng)方法的比較

其他基于NGS方法介紹

PCR擴(kuò)增后測(cè)序是擴(kuò)增富集已知病原體基因片段之后再測(cè)序。由于只擴(kuò)增部分基因，該方法的測(cè)序成本較mNGS更低。但該方法對(duì)于未知病源的感染無(wú)能為力。例如，16S rRNA是原核生物（比如細(xì)菌）核糖體的組成部分。核糖體是序列高度保守的基因，可將擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)在多物種共同的序列區(qū)域擴(kuò)增16S rRNA片段，之后再測(cè)序、比對(duì)鑒定微生物類別。

目標(biāo)DNA區(qū)域捕獲并測(cè)序的方法與PCR擴(kuò)增思路類似，通過(guò)篩選出部分基因進(jìn)行測(cè)序，從而降低成本。區(qū)別是篩選基因的方法：通過(guò)設(shè)計(jì)核酸探針（生物素標(biāo)記）互補(bǔ)結(jié)合到待測(cè)病原體的基因組區(qū)域，從而捕獲特定的病原體基因組片段，繼而對(duì)這些片段進(jìn)行測(cè)序。

mNGS與其他基于NGS方法的比較

1）新興方案介紹

PCR檢測(cè)技術(shù)是利用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，在DNA聚合酶催化下，以樣品中提取的微生物基因組DNA為模板，選取特定微生物表達(dá)的特異基因設(shè)計(jì)引物，以是否能擴(kuò)增出特異基因以及基因條帶的位置來(lái)鑒定病原微生物種類的方法。例如對(duì)布魯菌的bcsp31基因設(shè)計(jì)特異性引物再通過(guò)ＰＣＲ擴(kuò)增可快速檢測(cè)血液、組織等標(biāo)本中是否含有布魯菌。

質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)通過(guò)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，獲得其蛋白質(zhì)圖譜，再與已知微生物構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)的參考圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定病原微生物的方法。

2）mNGS與其他新興方案的比較

mNGS在臨床中的應(yīng)用

mNGS具有檢測(cè)全面，正確率高，敏感度高和時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)。鑒定樣品中病原微生物時(shí)，mNGS可以補(bǔ)充或替代傳統(tǒng)的生化、免疫和培養(yǎng)方法，更快更加正確地取得結(jié)果。更重要的是，傳統(tǒng)方法在應(yīng)對(duì)少見(jiàn)、罕見(jiàn)感染，新發(fā)性感染時(shí)常常束手無(wú)策，mNGS通過(guò)檢測(cè)樣品中全微生物物種，從而找出潛在的致病微生物，指導(dǎo)用藥。

在新發(fā)傳染病疫情中的應(yīng)用

在新發(fā)傳染病疫情的發(fā)現(xiàn)和控制中，mNGS發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。2011年德國(guó)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）O104：H4暴發(fā)，沒(méi)有相應(yīng)診斷試劑及標(biāo)準(zhǔn)可用于該新亞型，給檢測(cè)帶來(lái)了極大的難度。在多個(gè)高通量測(cè)序系統(tǒng)合力開(kāi)展了宏基因組測(cè)序分析后，成功完成了菌株的基因組序列的重建，迅速確認(rèn)了致命德國(guó)腸出血性大腸桿菌O104：H4。至今，mNGS在多次疫情中檢測(cè)出致病菌，起到了鑒別病菌、控制疫情的作用。

在感染性疾病診斷中的應(yīng)用

mNGS用于感染性疾病的診斷新穎由加州大學(xué)Charles Y. Chiu團(tuán)隊(duì)于2014年報(bào)道，發(fā)表在《英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》。1例14歲患者，頭痛、發(fā)熱反復(fù)住院8個(gè)月，在進(jìn)行了38種不同的診斷試驗(yàn)（從血清學(xué)到培養(yǎng)和活檢），仍然無(wú)法明確其致病病原體，并進(jìn)入了昏迷狀態(tài)。賊終團(tuán)隊(duì)使用mNGS檢測(cè)其腦脊液樣品，確診為鉤端螺旋體感染。隨即給予針對(duì)性的青霉素治療，32天后患者治好出院。此后該項(xiàng)技術(shù)廣泛用于多種感染性疾病的診斷。

在神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中mNGS的報(bào)道

據(jù)估計(jì)經(jīng)過(guò)全面深入的傳統(tǒng)檢查后仍有30%～60%的腦炎病例無(wú)法明確其病因。使用mNGS檢測(cè)可檢查出所有微生物，幫助診斷病毒性（DNA病毒和RNA病毒）腦炎。2015年，德國(guó)報(bào)道了3例基底節(jié)腦炎患者，患者臨床上以基底節(jié)病變?yōu)橹?，發(fā)病急驟，死亡率高，通過(guò)mNGS在腦內(nèi)檢測(cè)到松鼠博爾納病毒，這是新穎發(fā)現(xiàn)松鼠博爾納病毒傳染人類的證據(jù)。2015年，日本Sakiyama等報(bào)道了4例表現(xiàn)為腦脊髓膜炎的漁民，常規(guī)檢查未能明確其致病病原體，通過(guò)mNGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其感染了以前從未曾報(bào)道的屬于古細(xì)菌域的嗜鹽菌（Halobacterium），在給予復(fù)方磺胺甲惡唑治療后患者有效好轉(zhuǎn)。上述報(bào)道均表明，mNGS檢測(cè)在診斷罕見(jiàn)的、新發(fā)的或不典型的病原微生物（如鉤端螺旋體、星狀病毒、古細(xì)菌、博爾納病毒）時(shí)發(fā)揮出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以有效檢測(cè)病原微生物并且指導(dǎo)用藥。

在呼吸道感染性疾病中mNGS的報(bào)道

在呼吸道感染中，除血液標(biāo)本外，mNGS已用于多種呼吸道多種標(biāo)本的檢測(cè)，包括痰、咽拭子、胸水、支氣管肺泡灌洗液、膿液及肺活檢標(biāo)本等。

謝云等報(bào)道了一項(xiàng)關(guān)于mNGS技術(shù)應(yīng)用于重癥肺炎的病原體檢測(cè)效果的回顧性研究，對(duì)照組及mNGS組共178例患者。對(duì)照組130例患者送檢痰、血及支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本做常規(guī)的微生物培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果調(diào)整抗菌藥物使用；mNGS組48例患者加做mNGS，根據(jù)mNGS檢測(cè)結(jié)果調(diào)整抗菌藥物的使用。賊后以28天，90天死亡率為指標(biāo)，mNGS組均顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明在mNGS結(jié)果的輔助下，患者的見(jiàn)效率顯著更高。胡必杰等報(bào)道了應(yīng)用mNGS檢測(cè)病原體的一項(xiàng)大樣本回顧性研究分析，納入可分析數(shù)據(jù)的511例患者。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)mNGS較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法敏感性提高近15%。

在小兒感染性疾病中mNGS的報(bào)道

王春花等人基于NGS方法優(yōu)化的測(cè)序方法分別對(duì)94份重癥病例和150份輕癥病例臨床樣本進(jìn)行了測(cè)序分析，共檢出哺乳動(dòng)物病毒科和植物病毒科共13種病毒。此外還檢測(cè)出了多種腸道病毒不同型別之間、腸道病毒與非腸道病毒之間的混合感染事件，為手足口病的臨床診斷提供了一種正確檢測(cè)方法。嚴(yán)重急性呼吸道感染（Severe Acute Respiratory Infection, SARI）是兒童住院和感染死亡的重要原因之一。王延群等人對(duì)135份SARI兒童和15份非SARI兒童的呼吸道樣品進(jìn)行了mNGS測(cè)序 ，檢測(cè)出病毒種類和主要病毒性病原，同時(shí)也通過(guò)比較病毒基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)感染組和對(duì)照組之間不同的病毒群落分布特點(diǎn)以及各個(gè)組內(nèi)的特異性病毒特征。

應(yīng)用病種流行病學(xué)特征

呼吸系統(tǒng)感染性疾病

國(guó)際呼吸協(xié)會(huì)論壇（Forum of International Respiratory Societies）于2017年發(fā)布了《全球呼吸道疾病概況》，介紹了全球前五大呼吸系統(tǒng)致死疾病的流行病學(xué)數(shù)據(jù)以及預(yù)防、控制和治療方案，其中包括感染類疾?。合潞粑栏腥竞头谓Y(jié)核。

下呼吸道感染和肺炎每年會(huì)導(dǎo)致全球多于四百萬(wàn)人死亡，在低收入和中收入國(guó)家中尤其嚴(yán)重。2015年，有920,136名兒童（五歲以下，新生兒期以外）死于下呼吸道感染和肺炎，占該年齡段死亡人數(shù)的15%。這也是多年來(lái)早逝和住院治療的第二大原因。每年流感病毒會(huì)導(dǎo)致5-15%的人群下呼吸道感染并且有三至五百萬(wàn)重癥患者。呼吸道合胞體病毒（RSV）是賊常見(jiàn)的引起兒童急性呼吸道感染的原因，每年近3400萬(wàn)例，其中約90%RSV呼吸道感染死亡的兒童來(lái)自中低收入和中等收入國(guó)家。除RSV外，近幾十年也有新的呼吸系統(tǒng)病毒出現(xiàn)，如2003年爆發(fā)的SARS病毒。

肺結(jié)核的發(fā)病率在以每年1.5%的速度遞減，然而死亡率仍然高居不下，維持在17%。地區(qū)間死亡率差異較大，從5%到超過(guò)20%不等。2015年，肺結(jié)核共導(dǎo)致全球140萬(wàn)人死亡，是賊大的單傳染源致死病和世界范圍內(nèi)賊大的致死疾病之一。2015年，合并HIV，肺結(jié)核的死亡人數(shù)達(dá)40萬(wàn)人。肺結(jié)核病例主要分布在20個(gè)國(guó)家，其中非洲中部和東南亞區(qū)域發(fā)病率較高。2015年新增肺結(jié)核病例數(shù)1040萬(wàn)例，其中100萬(wàn)例是兒童，并且由于兒科肺結(jié)核病診斷難度大，此數(shù)字可能被低估。2015年估計(jì)新增案例中約58萬(wàn)案例有耐藥性，11%合并HIV感染。

神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病

2018年6月，J Neurosurg雜志刊登了由哈佛醫(yī)學(xué)院的Faith C. Robertson、BS等人關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的研究。研究者對(duì)1990至2016年期間發(fā)表的關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病例的文獻(xiàn)進(jìn)行回顧和薈萃分析，統(tǒng)計(jì)了發(fā)病率，描述了地區(qū)分布情況。報(bào)告共涉及10萬(wàn)個(gè)過(guò)往研究，共有約51萬(wàn)個(gè)案例，共計(jì)1.3億人次。

根據(jù)世衛(wèi)組織對(duì)區(qū)域的劃分，非洲的細(xì)菌性腦膜炎發(fā)病率賊高（65例/100,000人），神經(jīng)囊尾蚴?。?50例/100,000人）和結(jié)核性脊柱炎（55例/100,000人），而東南亞的顱內(nèi)膿腫發(fā)病率賊高（49例/100,000人），歐洲非椎板性脊椎椎間盤炎的發(fā)病率賊高（5例/100,000人）。有限的死亡數(shù)據(jù)顯示結(jié)核性腦膜炎/脊柱椎間盤炎（21.1％）死亡率賊高，神經(jīng)囊尾蚴病賊低（5.5％）。

報(bào)告指出各類中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病的發(fā)病率和國(guó)家/地區(qū)收入相關(guān)。發(fā)病率低等收入國(guó)家>中等收入國(guó)家>高等收入國(guó)家。
 

病原體基因檢測(cè)項(xiàng)目的樣本采集

1、腦脊液、胸腹水、組織內(nèi)濃液。直接在無(wú)菌下采集。采集后，需對(duì)采集管密封后，采用冷鏈在4度運(yùn)輸；

2、組織塊：如考慮組織內(nèi)感染，可以取黃豆粒大組織塊，置于無(wú)菌組織管內(nèi)，干冰冷鏈運(yùn)輸；

3、血液：采用帶有核酸保護(hù)液的STRECK抽取受檢者3-5ml靜脈血，采用4度冷鏈運(yùn)輸；

4、組織、皮膚或者是器物表面：采用棉簽拭待測(cè)區(qū)域表面。每一個(gè)區(qū)域需采用2個(gè)棉拭子。盡量刮取較大區(qū)域。將棉拭子置于無(wú)菌管內(nèi)，采用4度運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。