【佳學(xué)基因檢測(cè)】精子運(yùn)動(dòng)能力基因解碼如何指導(dǎo)基因檢測(cè)?
遺傳病、罕見病基因檢測(cè)導(dǎo)讀:
基因解碼是一種新型基因信息分析方法,它是基因檢測(cè)位點(diǎn)選擇和基因解讀的賊終理論和實(shí)踐依據(jù)。本文介紹了基因解碼是如何解析精子運(yùn)動(dòng)力產(chǎn)生的刺激信號(hào),精子細(xì)胞的鈣內(nèi)流這一過程的。它從一個(gè)方面揭示了男子不育癥的基因解碼和基因檢測(cè)的關(guān)系。
Catsper調(diào)控與[Ca2+]信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
基因解碼表明兩種鈣離子通道調(diào)節(jié)男性生育能力,這是男性不孕癥基因檢測(cè)中需要考慮到,才能檢測(cè)更全,不漏檢。(1)調(diào)節(jié)儲(chǔ)存控制的鈣離子的進(jìn)入的Orail通道,和(2)基因解碼研究賊廣泛的鈣離子通道Catsper通道。精子特異性Catsper通道控制細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)。采用小鼠所做的實(shí)驗(yàn)表明,Catsper1和Catsper2缺失小鼠的鞭毛彎曲幅度較正常小鼠的精子低。在Catsper1和Catsper2敲除小鼠中,增加精子內(nèi)[Ca2+]i鞭毛彎曲和振幅可以異常低水平增加到正常的預(yù)激活水平。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中,精子的活化依賴于鈣從細(xì)胞外空間或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器進(jìn)入精子細(xì)胞質(zhì)。因此,Catsper通道至少控制著精子的游動(dòng)行為。
pH調(diào)節(jié)Catsper離子通道
Catsper通道是一個(gè)pH敏感的離子通道,高pH水平是精子過度激活的必要條件。因此,調(diào)節(jié)精子酸堿特性的因素也會(huì)影響精子Catsper通道開放的程度?;蚪獯a研究發(fā)現(xiàn),小鼠精子在人工堿化的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致鈣離子增加。另外,孕酮、前列腺素和ZP3可通過增加[Ca2+]i誘導(dǎo)精子獲能和頂體反應(yīng)。然而,后來的基因解碼表明,這些生物活性分子在精子頂體反應(yīng)和獲能過程中引發(fā)的精子內(nèi)Ca2+的增加受精子內(nèi)pH微環(huán)境的影響。然而,目前還不有效清楚堿化對(duì)精子Catsper通道的影響。H+是酸堿微環(huán)境的主要調(diào)節(jié)者,Na+/H+交換蛋白(NHEs)和電壓門控H+通道1(HV1)是H+相關(guān)通道。NHEs將Na+導(dǎo)入質(zhì)膜并將H+輸出精子,而HV1去除細(xì)胞內(nèi)H+以維持精子中pH值(pHi)的平衡。此外,Ca2+腺苷三磷酸酶(Ca2+ATPase)泵從精子中去除細(xì)胞內(nèi)的Ca2+,同時(shí)允許H+通過質(zhì)膜進(jìn)入。相應(yīng)地,Catsper通道將Ca2+導(dǎo)入精子以維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。除此之外,Na,K-ATPase(NKA)和Na+/Ca2+交換蛋白(NCX)也會(huì)影響人類精子中的離子環(huán)境。事實(shí)上,高水平的細(xì)胞內(nèi)Ca2+和低水平的細(xì)胞內(nèi)H+有助于精子的過度活躍。不同離子通道與Catsper通道的關(guān)系如圖所示。?
H+通道
(1) Na+/H+交換通道
Na+/H+交換蛋白(NHEs)負(fù)責(zé)Na+和H+的交換。它們也是廣泛分布于所有原核生物和真核生物中的整合膜蛋白。NHEs包括由SLC9基因家族編碼,有13種NHE亞型,但在精子細(xì)胞中僅存在NHE1、NHE5和sNHE三種亞型。其中,sNHE是決定生育能力的關(guān)鍵亞型。也就是說,敲除NHE1和NHE5基因不會(huì)導(dǎo)致小鼠不孕,但是sNHE缺失或sNHE功能損傷會(huì)導(dǎo)致小鼠精子的活動(dòng)性和能動(dòng)性喪失而變得不育。通過提供氯化銨來提高pH值水平可以恢復(fù)部分生育能力,但是cAMP類似物可以有效恢復(fù)生育能力。此外,sNHE蛋白質(zhì)C末端具有一個(gè)核苷酸結(jié)合域。因此,sNHE亞型是生育能力所必需的,環(huán)核苷酸可能通過激活sNHE來控制Catsper通道和增加pHi。此外,sNHE有助于維持堿性環(huán)境,使Catsper通道進(jìn)一步調(diào)節(jié)超極化。除了維持精子的pH值動(dòng)態(tài)平衡外,sNHE還調(diào)節(jié)精子成熟度,促進(jìn)上皮細(xì)胞對(duì)鹽和水的吸收。干擾sNHE的功能的突變會(huì)導(dǎo)致不孕。因此,靶向sNHE可能是開發(fā)新的避孕方法的一個(gè)有希望的策略。與Catsper通道一樣,sNHE位于精子鞭毛的主要部分,這表明Catsper通道可以感知pHi變化帶來的sNHE的改變來調(diào)節(jié)Catsper功能。
(2) Hv1通道
Hv1是另一個(gè)電壓門控H+通道。與sNHE和Catsper通道類似,Hv1也位于精子鞭毛的主要部分。就其功能而言,Hv1和sNHE的主要區(qū)別在于Hv1僅通過從精子中去除細(xì)胞內(nèi)H+來維持細(xì)胞內(nèi)堿化。膜片鉗技術(shù)在人類精子獲能的生理過程中檢測(cè)到Hv1通道的負(fù)電流,這表明Hv1與精子獲能有關(guān)。有趣的是,這種負(fù)電流沒有從老鼠的Hv1通道檢測(cè)到。也就是說,小鼠精子中沒有H+通過Hv1排出。我們懷疑sNHE獨(dú)立完成小鼠精子的酸堿調(diào)節(jié)。如果是這樣的話,敲除小鼠Hv1基因應(yīng)該不會(huì)影響生育能力,但是沒有足夠的證據(jù)證明這一假設(shè),Hv1在小鼠體內(nèi)的實(shí)際作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
K+通道
sNHE誘導(dǎo)Na+和H+交換導(dǎo)致pHi升高,sNHE和Catsper均為電壓依賴通道。此外,細(xì)胞膜的超極化與電容有關(guān)。K+有助于維持精子膜電位的平衡。實(shí)現(xiàn)這一平衡的K+通道是SLO3和Kir通道。其中SLO3通道是精子特異性和pH敏感的K+通道。與Catsper通道類似,SLO3還與精子的多動(dòng)和運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)。影響Catsper通道的SLO3通道的另一個(gè)關(guān)鍵功能是維持精囊內(nèi)鞭毛的電流平衡。精子靜止跨膜電位范圍是−35至-45mv,但當(dāng)K+從細(xì)胞中移出并啟動(dòng)超極化時(shí),精子跨膜電位降低到-70mv。隨后觸發(fā)一系列生理過程,包括Na+/H+交換活化、精子獲能和精子結(jié)合ZP3。
鈣通道
精子中存在三種鈣離子相關(guān)通道(Catsper通道、Ca2+ATPase和Na+/Ca2+交換通道)。Catsper通道負(fù)責(zé)Ca2+進(jìn)入精子孔,促進(jìn)精子運(yùn)動(dòng)。Ca2+ATPase是一種Ca2+/H+交換蛋白,它去除細(xì)胞內(nèi)的Ca2+,并允許H+進(jìn)入精子細(xì)胞,與Catsper通道不同。Ca2+ATPase對(duì)Catsper通道和精子受精有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。此外,Na+/Ca2+交換蛋白從精子中輸出一個(gè)Ca2+離子,并允許三個(gè)Na+離子進(jìn)入,這對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的Ca2+平衡至關(guān)重要。
碳酸氫鹽(HCO3−) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
HCO3− 是精子獲能必不可少的,這通常被認(rèn)為是精子活力早期激活的開始。例如,經(jīng)人工堿化處理的小鼠精子產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加。添加HCO3− 顯示出同樣的效果,同時(shí)也增加了精子的跳動(dòng)頻率。這些數(shù)據(jù)表明HCO3的運(yùn)輸− 通過增加精子pHi影響精子活力。此外,HCO3− 激活非典型可溶性腺苷酸環(huán)化酶(sAC),增加cAMP水平,以及cAMP介導(dǎo)的途徑,增加鞭毛搏動(dòng)頻率(cAMP介導(dǎo)的途徑可以激活Catsper通道)。因此,HCO3− 激活Catsper通道是促進(jìn)Ca2+的增加,這可能是通過增強(qiáng)cAMP的生成來實(shí)現(xiàn)的。此外,CFTR是一個(gè)與人類精子獲能有關(guān)的Cl− 和HCO3−跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。CFTR通過調(diào)節(jié)cAMP信號(hào)通路來控制許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。值得注意的是,CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制會(huì)影響HCO3−-誘導(dǎo)cAMP增加,導(dǎo)致PKA活性降低。此外,降低CFTR活性也會(huì)通過調(diào)節(jié)cAMP下游信號(hào)級(jí)聯(lián)導(dǎo)致酪氨酸磷酸化降低和運(yùn)動(dòng)過度減少。HCO3− 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由精子中的SLC4、SLC26和CFTR基因家族編碼,這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中與pH調(diào)節(jié)相關(guān)的跨膜蛋白的主要家族。Western印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)、qRT-PCR和免疫沉淀結(jié)果表明,SLC26A3、SLC26A6和SLC9A3R1在小鼠精子鞭毛的中段被檢測(cè)到。在獲能和超極化過程中,這些蛋白質(zhì)相互作用以增加pH值。另一方面,HCO3− CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白位于鞭毛中部,但不與Catsper通道共定位?;蚪獯a推測(cè)HCO3− 通道通過影響頂體反應(yīng)間接影響Catsper通道的開放或關(guān)閉狀態(tài)。
HCO3− 精子活力的早期激活信號(hào)。HCO3的產(chǎn)生是由碳酸酐酶(CAs)催化完成的。因此,CAs在受精過程中對(duì)精子至關(guān)重要。佳學(xué)基因,一個(gè)致力于通過研究體體內(nèi)的生命過程從而解讀基因作用的專業(yè)機(jī)構(gòu)研究表明,CAs有三種作用:(1)催化生成HCO3−, (2) 調(diào)節(jié)精子的pHi,以及(3)調(diào)節(jié)精子頂體反應(yīng)。CAII和CAIV是具有催化活性的核心亞單位,敲除它們中的任何一個(gè)都會(huì)降低精子活力、精子運(yùn)動(dòng)速度和精子搏動(dòng)頻率。CAII位于精子的主要部分,Catsper通道也位于這里。另一方面,CAIV位于整個(gè)精子尾部的質(zhì)膜內(nèi)。對(duì)人類獲能精子和小鼠獲能精子施用碳酸酐酶抑制劑,如乙氧唑胺,結(jié)果表明,人類獲能精子的頂體反應(yīng)增加,但小鼠獲能精子的頂體反應(yīng)沒有增加。這些結(jié)果表明CAs在人和小鼠精子中具有不同的功能。然而,關(guān)于CAs如何參與精子受精的研究卻很少。CAs在運(yùn)動(dòng)過程中直接參與維持離子的平衡。例如,當(dāng)向精子注入二氧化碳時(shí),鞭毛搏動(dòng)頻率增加,并且這種效應(yīng)被乙氧基唑胺抑制。與野生型和CAIV−/− 小鼠相比較,CAIV的生理作用是為精子提供HCO3−,以刺激產(chǎn)生可溶性腺苷酸環(huán)化酶??傊妓狒缚梢杂绊憠A性環(huán)境和HCO3− 精子中的濃度。CAs可能通過調(diào)節(jié)Catsper通道影響精子頂體反應(yīng)。
調(diào)節(jié)Catsper通道的體內(nèi)生理信號(hào)
細(xì)胞外Ca2+如何進(jìn)入精子尚不清楚,但與受精相關(guān)的一些生理刺激通過Catsper通道誘導(dǎo)Ca2+進(jìn)入增加[Ca2+]i。這些刺激包括孕酮、環(huán)核苷酸(如cAMP、cGMP)、ZP糖蛋白、BSA和堿性去極化。這些元素共同誘導(dǎo)一系列的生理事件,包括獲能、頂體反應(yīng)和受精。
環(huán)核苷酸誘導(dǎo)鈣離子進(jìn)入
cAMP/PKA信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物中被用來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。事實(shí)上,精子獲能是一個(gè)cAMP依賴的過程,它上調(diào)Ca2+濃度和酪氨酸磷酸化水平。環(huán)腺苷酸由多種腺苷酸環(huán)化酶(ACs)合成,通常分為兩類:跨膜腺苷酸環(huán)化酶(tmACs)和sAC。重要的是,sAC介導(dǎo)的cAMP/PKA信號(hào)級(jí)聯(lián)對(duì)精子獲能至關(guān)重要,因?yàn)閟AC突變或sAC缺失的小鼠可以產(chǎn)生精子,但精子沒有向前運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致男性不育。給予sAC突變或sAC缺失小鼠cAMP類似物可以有效恢復(fù)先前喪失的運(yùn)動(dòng)能力,但精子在體外受精時(shí)仍然沒有表現(xiàn)出過度活躍。此外,sAC不僅參與cAMP的產(chǎn)生,還參與受精過程中的其他機(jī)制。具體來說,sAC在受精過程中有三種作用。首先,sAC是一種HCO3− 傳感器。HCO3-刺激后sAC結(jié)構(gòu)域發(fā)生重排−, sAC通過提高精子中cAMP水平而被激活。sAC的第二個(gè)功能是充當(dāng)pH傳感器。先前的研究表明,sAC調(diào)控著狗魚精子的酸堿平衡,其基因起到了監(jiān)測(cè)CO2和HCO3-濃度的作用,保持適宜的pH值微環(huán)境。sAC的賊后一個(gè)功能是作為鈣離子傳感器或鈣調(diào)素。作為HCO3-的替代品−, Ca2+能刺激sAC與ATP結(jié)合產(chǎn)生cAMP。環(huán)腺苷酸是一種第二信使分子,參與許多生理過程,包括精子向卵子的趨化和獲能。一項(xiàng)研究表明,細(xì)胞外cAMP/cGMP增加了Ca2+濃度。當(dāng)向精母細(xì)胞提供8-Br-cAMP/cGMP或提供堿性去極化以激活精母細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的Catsper依賴性增加從主節(jié)開始,并通過中段到達(dá)頭部。這個(gè)過程發(fā)生在幾秒鐘之內(nèi)。此外,與野生型精子相比,Catsper1突變精子的細(xì)胞內(nèi)ATP水平較低。此外,海洋無脊椎動(dòng)物中的cGMP信號(hào)功能是將趨化劑轉(zhuǎn)化為鞭毛中[Ca2+]i的增加,從而增加趨化過程中的游泳行為。所有這些發(fā)現(xiàn)都表明,環(huán)核苷酸誘導(dǎo)精子主體部分的鈣離子內(nèi)流,但沒有明確的證據(jù)表明,這一環(huán)核苷酸介導(dǎo)的過程直接參與誘導(dǎo)[Ca2+]i增加。然而,通過使用8-Br-cNMP處理的細(xì)胞,一項(xiàng)研究已經(jīng)證明,環(huán)核苷酸調(diào)節(jié)孕酮賊終增加[Ca2+]i。
基因解碼還發(fā)現(xiàn),Catsper通道在ZP誘導(dǎo)的Ca2+進(jìn)入小鼠精子過程中起著關(guān)鍵作用。使用膜片鉗技術(shù),在Catsper1空白小鼠精子中檢測(cè)不到ZP刺激2分鐘后的Ca2+電流,表明Catsper通道是ZP誘導(dǎo)[Ca2+]i增加所必需的,并表明ZP誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加從精子尾部開始并向精子頭部傳播。
ZP誘導(dǎo)Ca2+進(jìn)入
女性生殖道中的卵母細(xì)胞外面有一層叫做ZP的保護(hù)性外膜。卵母細(xì)胞周圍的ZP蛋白在受精過程中非常重要,因?yàn)榫又挥型ㄟ^ZP蛋白完成頂體反應(yīng)才能參與受精。事實(shí)上,ZP糖蛋白在小鼠體內(nèi)由三個(gè)亞單位組成:ZP1、ZP2和ZP3。而人精子中存在4個(gè)亞基ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。精子頂體與卵子ZP的接觸是如何導(dǎo)致[Ca2+]i增加的?事實(shí)上,精子接觸卵子時(shí),精子需要通過ZP的能力(這是通過[Ca2+]i增加實(shí)現(xiàn)的)。頂體通過胞吐過程分泌囊泡,賊終完成頂體反應(yīng)。早期的研究報(bào)道,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中向獲能精子中添加ZP可增加[Ca2+]i,而添加ZP抑制劑(即tyrphostin A48、百日咳毒素和3-quinuclidinyl benzilate)可抑制ZP誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)并降低小鼠精子中Ca2+的細(xì)胞內(nèi)濃度。這些效應(yīng)可能與G蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GalT-I)是ZP3的一種受體,它形成了一種異三聚體G蛋白復(fù)合物。GalT-I缺失小鼠精子仍能與ZP3結(jié)合,但精子失去了完成頂體反應(yīng)和跨越ZP的能力。與能完成頂體反應(yīng)的小鼠精子相比,人類精子不僅需要ZP3結(jié)合,而且需要ZP4結(jié)合。此外,哺乳動(dòng)物瞬時(shí)受體電位(Trp)蛋白是Ca2+通道受體,對(duì)調(diào)節(jié)Ca2+進(jìn)入小鼠精子至關(guān)重要。Trp被ZP3激活的G蛋白和磷脂酶C激活。ZP誘導(dǎo)的Ca2+進(jìn)入精子有助于產(chǎn)生頂體反應(yīng)和改變精子活力,這兩種功能都是通過附睪表達(dá)的β-防御素蛋白來實(shí)現(xiàn)的。
孕酮誘導(dǎo)鈣離子升高
黃體酮圍繞在雌性生殖道的卵子周圍,由卵丘細(xì)胞釋放。孕酮通過Catsper通道誘導(dǎo)Ca2+進(jìn)入精子,從而促進(jìn)頂體反應(yīng)。已經(jīng)深入研究過孕酮是如何調(diào)節(jié)鈣離子濃度的。當(dāng)人類精子暴露于孕酮濃度梯度以模擬精子接近卵子時(shí),發(fā)現(xiàn)[Ca2+]i增加。直接向培養(yǎng)基中添加鈣離子未能誘導(dǎo)這一過程,但添加肌漿/內(nèi)質(zhì)抑制劑可阻斷[Ca2+]i的增加。這些數(shù)據(jù)表明,孕酮誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流是通過釋放精子中儲(chǔ)存的Ca2+介導(dǎo)的,因此可能會(huì)影響精子的行為。Catsper通道增加[Ca2+]i的機(jī)制之一是通過釋放儲(chǔ)存的Ca2+,我們推測(cè)孕酮誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可能由Catsper通道介導(dǎo)。一項(xiàng)研究記錄了人類附睪和睪丸精子的Catsper電流,結(jié)果表明,Catsper通道在精子發(fā)育早期對(duì)孕酮敏感,這種敏感性在精子賊終射精時(shí)逐漸增加到峰值。蛋白激酶和磷酸酶參與孕酮誘導(dǎo)的Ca2+增加:添加PKA抑制劑或蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑可減少孕酮誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和孕酮誘導(dǎo)的頂體收縮。2010年,兩個(gè)研究小組提出,作為魚精子中的孕酮受體,Catsper通道起著增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用。此外,2011年的一項(xiàng)研究表明,孕酮是一種類固醇激素,通過一個(gè)明確的孕酮核受體調(diào)節(jié)Catsper基因的表達(dá),從而激活人類精子中的Catsper通道。此外,Catsper蛋白是一種非基因組孕酮受體,堿性pH和孕酮刺激Ca2+內(nèi)流,但被Catsper抑制劑NNC55–0396和mibefradil阻斷。
其他通過Catsper通道誘導(dǎo)Ca2+進(jìn)入的刺激物質(zhì)
另外一個(gè)促進(jìn)鈣離子通過Catsper通道進(jìn)入精子的刺激物是BSA。BSA在幾種哺乳動(dòng)物精子獲能中起作用。BSA也能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加,但在Catsper1基因敲除的精子中沒有這種作用。加入EGFP-Catsper1融合蛋白,恢復(fù)BSA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。用牛血清白蛋白觀察到的鈣濃度變化在幾秒鐘內(nèi)從精子主體傳播到中間部,賊終傳播到頭部。
(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)