【基因解碼】粘多糖?、裥突虺C正的研究和應(yīng)用

遺傳病、罕見病基因檢測導(dǎo)讀：

基因矯正技術(shù)是一種定向基因編輯技術(shù)。粘多糖病是一種溶酶體酶代謝性疾病。不同的患者可能具有類似的表型但是具有不同的致病基因。而基因矯正需要通過基因解碼正確地發(fā)現(xiàn)明確的致病基因位點后，從基因根源上進行矯正治療的方法。

粘多糖病I型及溶酶體病

溶酶體酶缺乏癥是一大類缺乏有效治療的遺傳性疾病。通過基因解碼找到明確的致現(xiàn)基因后，通過基因矯正進行治療是目前非常有潛力的一種治療方法。在佳學(xué)細(xì)胞這樣的干細(xì)胞做為載體的新型技術(shù)下，具有正常功能的基因信息被引入體內(nèi)，高效表達具有功能的蛋白質(zhì)，從而糾正生化缺陷并阻止疾病進展。本案例描述了一種有效的基因矯正方法，使用2020年諾貝爾獎技術(shù)，采用CRISPR-Cas9將溶酶體酶iduronidase靶向人類CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的CCR5安全港位點。修飾后的細(xì)胞分泌超內(nèi)源酶水平，維持長期的再增殖和多系分化潛能，并能改善免疫低下小鼠I型粘多糖病模型的生化和表型異常，這些研究為基因組編輯CD34+造血干細(xì)胞的開發(fā)提供了支持干細(xì)胞和祖細(xì)胞是治療粘多糖Ⅰ型的潛在方法。安全港方法為溶酶體酶的表達提供了一個靈活的平臺，使其適用于其他溶酶體儲存障礙。
 

溶酶體貯存性疾?。↙SDs）是由溶酶體蛋白缺乏引起的一大類遺傳性疾病，許多缺乏有效的治療方法。粘多糖癥I型（MPSI）是一種常見的LSD，其原因是iduronidase（IDUA）活性不足，導(dǎo)致糖胺聚糖（GAG）積聚和進行性多系統(tǒng)惡化，嚴(yán)重影響神經(jīng)和肌肉骨骼系統(tǒng)。目前對多發(fā)性硬化癥的干預(yù)措施包括酶替代療法（ERT）和異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）；這兩種療法的療效都很有限。ERT不跨越血腦屏障，需要終身治療，花費昂貴，長期治療還會產(chǎn)生抑制性抗體可以進一步降低酶替代療法的效果。Allo-HSCT可以持續(xù)提供酶源，組織巨噬細(xì)胞能夠遷移到受影響的器官，包括大腦，在病變組織提供局部酶活性，比ERT效果更好。但是，對于移植引起的疾病，包括移植后的不可逆性疾病的治療，包括移植后的并發(fā)癥，以及移植治療的不確定性。
 

MPSI的人類和動物研究表明，HSCT的治療效果可以通過增加循環(huán)IDUA水平來提高。在人類中，與來自MPSI雜合子的hspc移植患者相比，非攜帶者供體移植的患者具有更好的臨床反應(yīng)，并且酶表達降低。在小鼠中，將表達超正常酶水平的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPC）移植可顯著糾正表型?；诖耍《窘閷?dǎo)的高表達溶酶體酶的HSPCs的自體移植在LSDs（包括嚴(yán)重MPSI）的人體試驗中得到了探索(NCT03488394）和異染性白質(zhì)營養(yǎng)不良。過氧化物酶體疾病X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良也已通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體熱休克蛋白成功治療，盡管缺失酶的超正常表達可能并不重要，因為交叉校正不是該疾病的特征。這種自體方法消除了尋找免疫匹配供體的需要，并減少了同種異體移植的一些潛在并發(fā)癥。然而，與隨機插入病毒基因組、感染性微粒的攜帶、對某些載體的免疫反應(yīng)以及可變的轉(zhuǎn)基因表達有關(guān)的致瘤性的可能性仍然令人擔(dān)憂。
 

最近開發(fā)的基因組編輯工具將正確的基因添加與基因改變相結(jié)合，從而增加治療效益。其中，聚集規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白-9核酸酶（CRISPR/Cas9）是最簡單的工程化方法，并已成功地用于在培養(yǎng)基中修飾HSPC。該系統(tǒng)通過傳遞Cas9核酸酶和短引導(dǎo)RNA（sgRNA）被重新用于編輯真核細(xì)胞。當(dāng)靶向由sgRNA確定的序列時，Cas9產(chǎn)生一個雙鏈DNA斷裂，從而用設(shè)計的供體DNA模板刺激同源重組，該模板包含嵌入在斷裂位點中心的同源臂之間的所需基因修飾。這個過程被稱為“同源重組介導(dǎo)的基因組編輯”（HR-GE）是最常用的原位基因矯正方法，被譽為治療單基因疾病的工具。盡管其在LSDs中的治療潛力仍有待探索，但為了通過在某些LSDs中自體移植轉(zhuǎn)基因HSPCs來最大限度地提高治療效果，有時功能酶的表達水平必須高于內(nèi)源性水平。這可以通過將表達盒（感興趣的外源啟動子基因）插入非必要基因組區(qū)域（或“安全港”）來實現(xiàn)。
 

安全港提供了一個獨立于特定患者突變的平臺，易于適應(yīng)各種溶酶體酶，并且與慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，由于插入位點受到限制（常染色體中最多2個），因此確保了更可預(yù)測和一致的轉(zhuǎn)基因表達。此外，它的破壞對細(xì)胞增殖沒有影響，也沒有已知的致癌轉(zhuǎn)化潛力。

粘多糖病I型的基因矯正研究進展

基因矯正工程師CCR5為靶點，插入一個表達盒，在人CD34+HPSCs及其后代中過度表達IDUA。CCR5被認(rèn)為是一個非必需基因，因為CCR5的雙等位基因失活（CCR5?32）對人類健康沒有普遍的有害影響，CCR5缺失的唯一已知表型是對HIV-1感染的抵抗力和對西尼羅河病毒19的易感性增加?；虺C正工程師報告了人類HSPCs通過基因組編輯來表達CCR5位點的IDUA，并在一個新的免疫受損MSPI模型中改善了疾病的生化、內(nèi)臟、肌肉骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。

粘多糖I型病的基因矯正安全嗎？

為了評估基因毒性和搞清CCR5港脫靶效應(yīng)，基因矯正工程師使用了基于生物信息學(xué)的工具COSMID（CRISPR脫靶位點與錯配位點、插入和缺失）。在CB衍生的HSPCs的兩個重復(fù)實驗，用深度測序法測定了共67個可能的脫靶效應(yīng)位點。在每一個重復(fù)實驗中，比較了模擬細(xì)胞和用RNP電穿孔的細(xì)胞與野生型（WT）Cas9或高保真度（HiFi）Cas937所測得的百分比指數(shù)。67個位點中有5個位于重復(fù)單元內(nèi)，重復(fù)與缺失不能明確到特定的位點。對于剩下的62個基因組位置，如果：（1）該位點的indels百分比大于0.1%（檢測限），（2）兩個重復(fù)樣本中存在脫靶效應(yīng)，以及（3）RNP中的indels高于模擬樣本，則認(rèn)為這些位點是真正的脫靶。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，只有四個位點被認(rèn)為是真正的偏離目標(biāo)。對于所有這些部位，Indels的頻率<0.5%，使用HiFi-Cas9可以有效消除脫靶效應(yīng)，同時保持了靶向效率。只有一個外顯子位點出現(xiàn)在SUOX基因（亞硫酸鹽氧化酶）。在該部位測得的最高脫靶比例為0.128%，低于HiFi-Cas9的檢測限。這些數(shù)據(jù)表明，CCR5-sgRNA與WT-Cas9，特別是HiFi-Cas9結(jié)合，在生物信息學(xué)預(yù)測的大屏幕上，其脫靶效應(yīng)可以忽略不計。

基因矯正的研究表明，在原代細(xì)胞中，Cas9介導(dǎo)的DSBs導(dǎo)致p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，從而降低HR-GE的效率。因此，當(dāng)選擇成功接受HR-GE的細(xì)胞時，p53陰性克隆的富集潛力引起了人們的關(guān)注。為了檢測p53在我們的細(xì)胞中的功能，我們針對四個生物樣本（兩個CB和兩個PB衍生的）來表達PGK-IDUA-YFP盒，并分離出mock、YFP+（接受HR-GE的細(xì)胞）和YFP−（未進行HR-GE的細(xì)胞）。因為p53克隆可能是一個罕見的具有生長優(yōu)勢的群體，為了增加檢測概率，細(xì)胞被允許擴大100-150倍（約2周）?；虺C正工程師首先使用臨床驗證的下一代測序分析，對所有四個樣本的三種情況下的所有TP53外顯子（NM_000546.5）進行測序。盡管體外擴增，在HR-GE+細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)新的TP53序列變異。與此一致，在用DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑阿霉素、mock、HR-GE+和HR-GE-細(xì)胞處理后，當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測p53蛋白穩(wěn)定性和qPCR測量的七個p53靶基因的轉(zhuǎn)錄激活時，沒有可以辨別的信號。

基因矯正工程師總共進行了200次尸檢（101只小鼠用于初次植入，50只用于二次植入，49只用于NSG-IDUAX/X校正研究），在這些尸檢中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤。實現(xiàn)中出現(xiàn)了三個腫瘤樣腫塊，經(jīng)組織學(xué)檢查證實為膿腫。這200只小鼠被移植了9000萬經(jīng)過基因矯正后的人類細(xì)胞?？紤]到MSPI患者HSCT的中位年齡約為1歲，平均體重為10 Kg，本研究中使用的基因矯正細(xì)胞數(shù)是正常劑量的兩倍（4.5×10⁶ CD34 HSPCs/Kg）。因此，明顯缺乏致瘤性和CCR5 sgRNA的低脫靶效應(yīng)說明該基因矯正方案是安全的。

關(guān)于粘多糖病基因矯正的真實應(yīng)用

基因矯正的臨床應(yīng)用是一個嚴(yán)肅的、充滿希望的方法。但是該方法的應(yīng)用需要患者的理解和配合，同時需要滿足監(jiān)管部門的要求，經(jīng)過專家的嚴(yán)格審評。請不同的基因病患者關(guān)注佳學(xué)基因的研究進展，向佳學(xué)基因基因矯正研究基金捐助科研經(jīng)費，積極宣傳基因解碼和基因矯正知識，共同促進粘多糖基因矯正方案的早日實施。

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